Summary
Cet article décrit comment injecter des vecteurs viraux dans le cortex frontal de la souris pour tester tests comportementaux qui nécessitent la formation hétéromère GPCR.
Introduction
Hallucinogènes, comme le LSD, la psilocybine et la mescaline provoquent des changements importants dans la conscience humaine, la cognition et l' émotion 7-9. L' inactivation de la sérotonine 5-HT signalisation du récepteur 2A par des approches génétiques ou pharmacologiques soit provoque nettement atténué les réactions comportementales aux hallucinogènes dans les deux modèles de rongeurs 3,10 et humains 11. Bien que les hallucinogènes se lient d' autres sous - types de récepteurs 8, le récepteur 5-HT2A est considéré comme nécessaire à l'activité comportementale unique de ces produits chimiques.
Groupe II récepteurs de glutamate métabotropique (ie., MGlu2 et mGlu3) ont été la cible d' une attention considérable en ce qui concerne le mécanisme moléculaire d'hallucinogènes et de leur rôle essentiel qui sous - tend la psychose 12. Auparavant, il a été démontré que des souris sans expression de la protéine mGlu2 (souris mGlu2-KO) sont insensibles aux effets cellulaires et comportementaux hallucinogens 5. Il a également été suggéré que la 5-HT 2A et les récepteurs de mGlu2 forment un complexe hétéromère spécifique à travers lequel la sérotonine et de glutamate de ligands modulent le motif de G couplage des protéines dans les cellules vivantes 1,2.
Structurellement, transmembranaires (TM) , les domaines 4 et 5 de mGlu2 jouent un rôle fondamental dans la formation hétéromère avec le récepteur 5-HT 2A 5. En outre, une investigation a montré que trois résidus situés à l'extrémité intracellulaire de TM4 de mGlu2 sont nécessaires pour former la 5-HT 2A -mGlu2 hétérocomplexe de récepteur dans des cellules vivant à 6.
Sur la base de ces résultats observés dans les systèmes d'expression hétérologues, ici , nous décrivons l'utilisation de l' expression HSV-médiée de type sauvage mGlu2 et mGlu2 / mGlu3 constructions chimériques dans le cortex frontal des souris mGlu2-KO pour vérifier si la formation hétéromère entre 5-HT 2A et mGlu2 est nécessaire pour lacomportement tête contraction induite par hallucinogènes 5-HT des agonistes des récepteurs de 2A.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures pour l'élevage et soins des animaux ont été menées conformément à la réglementation du Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de Mount Sinai School of Medicine. Assurez-vous d'utiliser des gants stériles pendant toute la procédure.
1. drogues et Virus Préparation
- Préparation des médicaments
- Préparer 15,0 ml de kétamine / xylazine anesthésique en dissolvant 1,35 ml de 100 mg / ml de kétamine et 0,75 ml de 20 mg / ml de xylazine dans 12,9 ml de 0,9% de solution saline. Bien mélanger la solution.
- Préparation de virus
- Clone du mGlu2 et mGlu2ΔTM4N construit dans un vecteur virus bicistronique herpès simplex (HSV) suivant les protocoles standard décrits précédemment 6. Emballez les particules virales comme décrit précédemment 6,13,14. Remplacement des résidus Ala-677 4,40, Ala-681 4,44 et 4,48 Ala685 dans mGlu2 pour Ser686 4,40, PhE690 4,44 et Gly-694 à 4,48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) ont été décrits précédemment 6.
NOTE: Il a été précédemment démontré que la construction chimère HA mGlu2ΔTM4N est exprimé à la membrane plasmique par G intacte protéine dépendante de la signalisation 6. - Stocker des vecteurs viraux à -80 ° C lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation. vecteur viral Thaw sur la glace, puis aliquote en 10 aliquotes. Pour l'intervention chirurgicale, garder sur la glace.
- Clone du mGlu2 et mGlu2ΔTM4N construit dans un vecteur virus bicistronique herpès simplex (HSV) suivant les protocoles standard décrits précédemment 6. Emballez les particules virales comme décrit précédemment 6,13,14. Remplacement des résidus Ala-677 4,40, Ala-681 4,44 et 4,48 Ala685 dans mGlu2 pour Ser686 4,40, PhE690 4,44 et Gly-694 à 4,48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) ont été décrits précédemment 6.
2. Surgery
- Préparation de la chirurgie
- Peser la souris et injecter la souris avec une dose appropriée de kétamine / xylazine cocktail (pour plus de détails, voir 1.1.1).
- Vérifiez la souris pour voir si elle est correctement anesthésié, presser le pied et la queue pour la réponse de la douleur, en cas d'impossibilité d'obtenir une réponse, la souris est correctement anesthésié.
- Raser la tête de la souris à partir de la base du crâne à la pointe du nez à l'aide clippers. Appliquer le gel ophtalmique à l'af de la souristerward pour prévenir la cécité de la souris.
- Chargez chaque seringue sur le cadre stéréotaxique. Puis basculer la partie verticale de chaque bras du cadre stéréotaxique de sorte qu'ils sont à 10 degrés par rapport à la normale. Faire en sorte que les bras sont inclinés de telle sorte que les aiguilles se font face.
- Nettoyez chaque seringue en remplissant l'aiguille avec 70% d'éthanol. Remplir l'aiguille au moins trois fois pour s'assurer que la seringue est propre.
- Une fois que l'aiguille a été nettoyé, rincer l'aiguille en remplissant l'aiguille avec double H distillée 2 O. Une fois rincée, remplir chaque aiguille avec 1,3 pi de la double H distillée 2 O. Tournez le piston de la seringue pour libérer 0,3 ul d' une double H distillée 2 O. Si l'eau perle à la pointe de l'aiguille, essuyez soigneusement l'eau. Si rien ne sort de la seringue, pousser le piston complètement vers le bas et puis répétez le nettoyage de la seringue.
- Après avoir rempli avec de l'eau, puis retirez la seringue de remplissage de la seringue avec0,5 pi de l'air.
- Une fois que l'air et l'eau sont dans la seringue, remplissez soigneusement la seringue avec 1,3 pi de solution de virus. À ce stade, faire en sorte que le volume total dans la seringue est de 2,8 pi. Encore une fois tourner la pointe de la seringue pour libérer 0,3 ul de virus. Si des perles liquides à la pointe de l'aiguille, essuyez soigneusement liquide. Si rien ne sort de la seringue, pousser le piston complètement vers le bas et puis répétez le nettoyage de la seringue.
- Chirurgie
- Fixer la souris sur le cadre stéréotaxique, en veillant à ajuster le cadre stéréotaxique de telle sorte que le crâne est plat et plat. Appliquer povodine iodée sur le cuir chevelu exposé. À l'aide d'un scalpel, une incision sagittale le long de la ligne médiane du crâne à l'intérieur de la zone rasée exposée. Ensuite, fixez les pinces de burette à la peau au niveau du site d'incision pour faire en sorte que le crâne reste exposé.
- Utilisez H 2 O 2 à dissoudre le périoste pour exposer les sutures de lacrâne. Maintenant que le bregma et les sutures sont visibles, assurez-vous d'ajuster le cadre stéréotaxique pour vous assurer que le crâne est de niveau.
- Aligner les pointes d'aiguilles des seringues avec le bregma et enregistrer les coordonnées du bregma. Calculer les coordonnées du où vont être insérées les aiguilles.
- Pour le plan Rostral-Cauldal (RC), ajouter 1,6 mm aux RC coordonnées enregistrées de Bregma (+1,6 de bregma). Pour le plan dorso-ventral (DV), soustraire 2,4 mm à partir des coordonnées de Bregma DV enregistrées (-2,4 de bregma).
- Enfin, pour le plan médial latéral (ML), ajouter 2,6 mm aux ML coordonnées enregistrées de Bregma (+2,6 de bregma). Pour toutes les coordonnées assurez-vous d'enregistrer les deux coordonnées gauche et à droite, car cela est une injection bilatérale.
- Amener les aiguilles aux coordonnées désirées. Marquez les lieux d'où vont être insérés et avec une perceuse, percer les zones marquées les aiguilles.
- Avec une pointe de coton applicateur wipe loin de sang ou de moelle fragment excès.
- Amener les aiguilles du crâne où les pointes des aiguilles sont en contact avec la surface du cerveau. Abaissez ensuite les aiguilles pour les coordonnées désirées en les abaissant lentement.
- Une fois que les aiguilles sont les coordonnées désirées, injecter lentement le contenu de la seringue en tournant le piston de l'aiguille 0,1 ul par minute au cours de 5 min (au total 0,5 pi).
- Une fois que l'injection a été faite laisser la seringue dans le cortex pendant 5 min.
- Fermeture Up / Soins
- Retirez les aiguilles du cortex de souris régulièrement et lentement. Retirez ensuite la souris du cadre stéréotaxique.
- Appliquer cyanoacrylate (colle cutanée) sur les rabats de base de la peau de l'incision, puis avec une pince saisissent les lambeaux de peau et de les placer ensemble.
- Laisser le cyanoacrylate sécher. Placez la souris dans une cage sur un coussin chauffant (coussin chauffant est facultatif si le surgSuite ical est maintenue sous RT de 37 ° C - sinon pas nécessaire). Assurez-vous de placer la souris sur une serviette en papier pour vous assurer que la literie ne respecte pas le site chirurgical.
- En fonction de la durée de l'intervention chirurgicale, en sorte que la souris est hors de l'anesthésie à l'intérieur de 30 - 60 minutes après l'intervention. Après la chirurgie, l'animal est placé dans sa propre cage et surveillé jusqu'à ce qu'il devienne conscient avant de retourner à sa chambre pour récupérer. Aucun analgésiques sont utilisés en post-opératoire, car ils peuvent modifier les résultats de nos expériences en modifiant certaines des voies biochimiques cérébrales. Toutefois, les animaux sont surveillés jusqu'à ce qu'ils récupèrent de l'anesthésie sur le jour de la chirurgie, et post-fonctionnement quotidien des signes d'infection et de l'évaluation de la douleur / détresse.
Expérience 3. Réponse Head Twitch
- Installer
- Effectuer tous les tests de comportement 10h00-14:00, 2 - 3 jours après stereotainjection CTIC de particules virales.
- Dissoudre le (±) -1- (2,5-diméthoxy-4-iodophényl) de chlorhydrate -2-aminopropane (DOI) dans une solution saline à 0,9% à 2,0 mg / kg. Aussi préparer une solution saline à 0,9%.
- Préparer une cage à la maison (28 x 18 x 15 cm) sans literie et en utilisant un tri-pod, régler une caméra de sorte que la vue de la caméra vidéo est directement au-dessus de la cage de la maison.
- Habituer les souris à la salle pendant au moins 4 heures avant le début de l'expérience.
- Mettre en place un caméscope pour enregistrer la contraction de la tête.
- Expérience
- Placez la caméra de sorte qu'il est directement au-dessus d'une cage à la maison. Calibrer la caméra de sorte que l'ensemble de la cage de la maison se trouve dans le champ de vision.
- Peser la souris et injecter la souris par voie intrapéritonéale avec une dose appropriée soit 0,9% de solution saline ou DOI (0,01 ml / g). NOTE: Si une souris pèse 25 grammes, administrer la dose à un volume total de 0,25 ml.
- Placez chaque souris de retour dans leur cage for 10 min. Au bout de 10 min, le lieu souris dans le centre de la cage vide et valider qu'il n'y a pas de taches aveugles dans le champ de vision de la caméra. Appuyez sur disque sur le caméscope. Quitte la pièce.
REMARQUE: les mouvements de la souris et diverses réponses comportementales qui y sont (... La tête Twitch, oreille scratch, etc S'il vous plaît se référer au supplément tableau de données 1 2007 Gonzalez-Maeso et al pour la liste complète des réponses comportementales induites par DOI) 3, seront enregistrées pour 30 minutes. Par conséquent, il est important, il n'y a pas de taches aveugles dans le champ de vision enregistrée. - Au bout de 30 min arrêter l'enregistrement sur le caméscope et le lieu souris retour dans la cage de la maison d'origine. Répétez ce processus pour chaque souris.
- La revue
- Demandez à chaque examen de l' arbitre les bandes aveugles aux conditions expérimentales de la souris (ie., Médicaments utilisés pendant la tête twitch expérience ou virus utilisé lors de l' injection intracrânienne)). enregistrer manuellement chaque tête twitch throughout la vidéo.
NOTE: Head-tic est défini comme un mouvement de la tête d'agitation rapide menée par une souris (vidéo supplémentaire). - Pour chaque souris, la moyenne de la réponse du HTR final des trois totaux des arbitres aveugles. Ensuite groupe ces valeurs par condition expérimentale et effectuer une analyse statistique (ie., T-test ou ANOVA).
- Demandez à chaque examen de l' arbitre les bandes aveugles aux conditions expérimentales de la souris (ie., Médicaments utilisés pendant la tête twitch expérience ou virus utilisé lors de l' injection intracrânienne)). enregistrer manuellement chaque tête twitch throughout la vidéo.
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Representative Results
Des résultats antérieurs démontrent que la tête-twitch réponse comportementale murin est fiable et robuste provoquée par les hallucinogènes, et il est absent dans 5-HT 2A -kō souris 3. En outre, il a été démontré que la réponse de la tête contraction provoquée par les hallucinogènes 5-HT 2A agonistes DOI et le LSD a été significativement diminuée chez les souris KO mGlu2-5. Cependant, bien que les résultats antérieurs démontrent de façon convaincante que le 5-HT 2A et mGlu2 sont assemblés comme un complexe hétéromère in vitro dans des cellules transfectées 1,2,15, si cet arrangement structurel se comporte en tant que telle dans des souris vivantes restées sans solution. Pour bien comprendre le rôle de la 5-HT 2A -mGlu2 hétérocomplexe des récepteurs dans les effets psychoactifs comme induits par hallucinogènes 5-HT des agonistes des récepteurs 2A, l' expression des deux mGlu2 ou mGlu2ΔTM4N dans le cortex frontal des souris mGlu2-KO d'examiner si cette manipulation régule le comportement.
Les souris ont reçu des injections intra-corticales frontale de bicistronique HSV exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) et soit mGlu2 ou mGlu2ΔTM4N ou GFP seule. Tout d' abord, il a été confirmé que le virus surexprime mGlu2 ou mGlu2ΔTM4N dans le cortex frontal de la souris (figures 1A et 1B). Comme démontré précédemment 5, le comportement tête contraction induite par DOI était absente chez les souris mGlu2-KO injectés avec le vecteur vide HSV-GFP. En particulier, la réponse tête contraction induite par les hallucinogènes 5-HT 2A agoniste du DOI a été sauvé chez la souris mGlu2-KO surexprimant mGlu2, mais pas mGlu2ΔTM4N, dans le cortex frontal par rapport à celle observée chez les animaux exprimant la GFP (figure 1C). Ensemble, ces résultats suggèrent que le complexe récepteur 2A -mGlu2 5-HT dans le cortex frontal est essentiel pour la régulation des états de psychose semblable.
Figure 1. Expression de mGlu2 comme un récepteur hétérocomplexe. L' expression de mGlu2 comme un récepteur de 5-HT 2A est nécessaire pour le comportement psychotique induit par des drogues hallucinogènes. (A) d'image représentant l' expression du transgène HSV-médiation dans le cortex frontal. HSV-mGlu2, qui exprime également la GFP, a été injecté dans le cortex frontal, et l'expression de la GFP a été révélé par immunocytochimie, barre d'échelle, de 200 um. (B) HSV-médiée expression du transgène chez la souris cortex frontal des souris mGlu2-KO, et la réactivité anti-mGlu2 a été mesurée par Western Blot. La spécificité de l'anticorps primaire contre le récepteur mGlu2 a déjà été confirmée chez la souris knock-out 6. Les récepteurs métabotropiques du glutamate sont GPCR qui forment des homodimères liés par liaison covalente. Nous avons mesuré immunoréactivité de mGlu2 comme monomère (100 kDa) 6. (C et al (2012) 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo supplémentaire 1. Réponse Head Twitch. (Clic droit pour télécharger). Des souris CD-1 WT ont été injectés avec 2,0 mg / kg DOI et placés dans une cage (mur noirci entre les deux cages) pour obtenir une réponse tête twitch (comportement provoqué après *).
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Discussion
Ainsi que les résultats précédents en mGlu2-KO 5 souris, les résultats obtenus avec mGlu2 et mGlu2 / mGlu3 constructions chimères qui ne forment pas le complexe récepteur 2A -mGlu2 5-HT dans des cellules en culture suggèrent que la 5-HT 2A -mGlu2 complexe récepteur hétéromère en souris cortex frontal est nécessaire pour induire un comportement tête twitch par hallucinogènes 5-HT des agonistes des récepteurs 2A LSD-like. Une limitation de cette méthode est qu'elle ne mesure pas la proximité moléculaire étroite à un niveau subcellulaire dans le tissu natif. En outre, il existe plusieurs points critiques à noter. Parce que les souris sont injectées avec un vecteur viral HSV, le laps de temps que les expériences à effectuer sont 2 - 4 jours après l'injection. L'emplacement et l'expression des vecteurs viraux doivent être vérifiées immunofluorescence du cerveau en coupe pas plus de 4 jours après l'injection initiale. Les souris dont les coordonnées ne correspondent pas ou ne pas exprimer le vecteur viral devraitêtre exclues des données expérimentales car ils ne reflètent pas la mGlu2 ou mGlu2ΔTM4N. Soins après la chirurgie stéréotaxique est également crucial, car une mauvaise fermeture de la blessure à la tête peut conduire à une infection qui peut causer des problèmes à la fois les expériences in vivo et la coloration d'immunofluorescence. Enfin, après l' injection stéréotactique quelconque paradigme comportemental (. Plein champ, en alternant le test t, etc.) peut être utilisé aussi longtemps qu'il se situe dans la 2 - 4 après injection de particules virales. Encore une fois, les coordonnées et l'expression doivent être confirmés par immunofluorescence.
Le concept selon lequel la fonction de GPCR sous forme d' homo- et / ou des hétéromères dans les cellules vivantes est maintenant bien établi 16-18. Cependant, en dépit de certains progrès, d' autres études sont nécessaires pour définir le rôle (s) précis de complexes hétéromères GPCR dans les modèles entiers d'animaux 19. Des approches telles que BRET et / ou imagerie FRET pour enquêter sur protéine-protéine proximité physique dans les tissus profonds de petit animalmodèles peuvent fournir des moyens pour améliorer la compréhension du rôle fonctionnel des hétéromères GPCR chez les sujets de 20 vivant. HSV en utilisant l' expression à médiation par des GPCR soit native ou avec des protéines transmembranaires modifiées, fournir un modèle in vivo pour évaluer la fonction et l' interaction des GPCR.
D' autres études dans des modèles de rongeurs sont également nécessaires pour étudier la stabilité et la durée de vie (formation et de dissociation) des hétéromères GPCR 21-23 réarrangements structuraux entre les composants 24 et G couplage potentiel de protéine après internalisation du récepteur 25,26. Étant donné le rôle fondamental des GPCR dans la signalisation et la fonction cellulaire, il semble probable que cette zone pourrait conduire à des études de base et de traduction intéressantes.
Bien que d'autres études sont nécessaires pour caractériser quantitativement la co-localisation ultrastructurale des deux récepteurs du système nerveux central humain et la souris, ainsi que stu précédentematrices qui démontrent de façon convaincante l'électrophysiologique, cellulaire et les réponses comportementales induites par les hallucinogènes dans les modèles de souris sont intrinsèques à 5-HT 2A neurones pyramidaux corticaux exprimant le récepteur 3,27,28, les résultats obtenus en utilisant l'approche d'expression HSV-médiation décrites ici suggèrent que la formation hétéromère entre 5-HT 2A et mGlu2 récepteurs chez la souris cortex frontal est nécessaire pour la psychose comme le comportement de la tête à contraction induite par le hallucinogène 5-HT agoniste du récepteur 2A DOI.
MGlu2 expression de HSV-médiée, mais pas mGlu2ΔTM4N, dans les neurones du cortex frontal des souris KO mGlu2-secourt le comportement tête contraction induite par la 5-HT hallucinogène agoniste du récepteur A2A DOI. Cet outil de translation peut être avantageux pour les études précliniques pour évaluer les phénotypes comportementaux des hétéromères GPCR.
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Acknowledgments
NIH R01MH084894 a participé au financement de cette étude. Nous tenons à remercier les Drs. Yasmin Hurd et Scott Russo au Mount Sinai School of Medicine pour le don de la souris et l'utilisation de leurs installations de chirurgie et de comportement pendant le tournage de ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mGlu2 bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| mGlu2ΔTM4N bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| Xylazine | Lloyd | List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ketamine | Vedco | KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ophthalmic gel | Fisher Scientific | NC0550805 | |
| Burret clips | Fisher Scientific | NC9268369 | |
| Feather surgical blade | Fisher Scientific | NC9032736 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 19-898-919 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14815203 | |
| Hamilton™ Small Hub Removable Needles (33 Ga) | Fisher Scientific | 14816206 | |
| Cordless Micro Drill | Fisher Scientific | NC9089241 | |
| Dermabond Dermal Adhesive | Fisher Scientific | NC0690470 | |
| (±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI) | Sigma-Aldrich | 42203-78-1 | Dissolved in 0.9% saline solution to the concentration of 2.0 mg/kg |
References
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