Summary
En este artículo se describe cómo inyectar vectores virales en la corteza frontal del ratón para probar los ensayos de comportamiento que requieren la formación heteromérica GPCR.
Introduction
Alucinógenos, como el LSD, psilocibina y la mescalina causan cambios significativos en la conciencia humana, cognición y la emoción 7-9. La inactivación de la señalización del receptor de serotonina 5-HT 2A mediante enfoques ya sea genéticos o farmacológicos hace que atenuó marcadamente las respuestas de comportamiento a los alucinógenos, tanto en modelos de roedores y seres humanos 3,10 11. A pesar de los alucinógenos se unen otros subtipos de receptores 8, el receptor 5-HT 2A se considera necesario para la actividad de comportamiento único de estos productos químicos.
II receptores de glutamato metabotrópicos del grupo (es decir., MGlu2 y mGlu3) han sido objeto de considerable atención en relación con el mecanismo molecular de alucinógenos y su papel integral psicosis 12 subyacente. Anteriormente, se ha demostrado que los ratones con ninguna expresión de la proteína mGlu2 (ratones mGlu2-KO) son insensibles a los efectos celulares y de comportamiento de hallucinogens 5. También se ha sugerido que el 5-HT2A y los receptores mGlu2 forman un complejo heteromérico específico a través del cual los ligandos de la serotonina y el glutamato modulan el patrón de acoplamiento de proteínas G en las células vivas 1,2.
Estructuralmente, transmembrana (TM) dominios 4 y 5 de mGlu2 desempeñan un papel fundamental en la formación heteromérica con el 5-HT 2A receptor 5. Además, una mayor investigación demostró que tres residuos situados en el extremo intracelular de TM4 de mGlu2 son necesarios para formar la 5-HT heterocomplejo receptor 2A -mGlu2 en las células 6 viviente.
Sobre la base de estos hallazgos observados en sistemas de expresión heterólogos, aquí se describe el uso de la expresión mediada por HSV de tipo salvaje mGlu2 y mGlu2 / mGlu3 construcciones quiméricas en la corteza frontal de ratones mGlu2-KO para probar si la formación heteromérica entre el 5-HT 2A y mGlu2 es necesario para lael comportamiento de cabeza de contracción inducida por alucinógenos agonistas de los receptores 5-HT 2A.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos para la cría de animales y de los cuidados se llevaron a cabo de acuerdo con el Reglamento del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí. Asegúrese de usar guantes estériles durante todo el procedimiento.
1. Drogas y Preparación Virus
- Preparación de drogas
- Preparar 15,0 ml de ketamina / xilazina anestésico por disolución de 1,35 ml de 100 mg / ml de ketamina y 0,75 ml de 20 mg / ml de xilazina en 12,9 ml de 0,9% de solución salina. Mezclar bien la solución.
- Preparación Virus
- Clonar el mGlu2 y mGlu2ΔTM4N construye en un vector de virus herpes simplex bicistrónico (HSV) siguiendo los protocolos estándar descritos previamente 6. Empaquetar las partículas virales como se ha descrito previamente 6,13,14. La sustitución de los residuos de Ala-677 4.40, Ala-681 4,44 y 4,48 Ala685 en mGlu2 de Ser686 4.40, PhE690 4.44 y Gly-694 4,48 en mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) se han descrito previamente 6.
NOTA: Se demostró previamente que la construcción quimérica HA-mGlu2ΔTM4N se expresa en la membrana de plasma con G intacta dependiente de la proteína de señalización 6. - Almacenar vectores virales en -80 ° C cuando no esté en uso. vector viral deshielo en el hielo, y luego alícuota en 10 ml de alícuotas. Para el procedimiento quirúrgico, mantener en hielo.
- Clonar el mGlu2 y mGlu2ΔTM4N construye en un vector de virus herpes simplex bicistrónico (HSV) siguiendo los protocolos estándar descritos previamente 6. Empaquetar las partículas virales como se ha descrito previamente 6,13,14. La sustitución de los residuos de Ala-677 4.40, Ala-681 4,44 y 4,48 Ala685 en mGlu2 de Ser686 4.40, PhE690 4.44 y Gly-694 4,48 en mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) se han descrito previamente 6.
2. Cirugía
- Preparación de la cirugía
- Pesar el ratón y el ratón con inyectar dosis apropiada de cóctel de ketamina / xilazina (para más detalles, véase el punto 1.1.1).
- Compruebe ratón para ver si anestesiado adecuadamente, apriete el pie y la cola de la respuesta al dolor, si no puede obtener una respuesta, el ratón se anestesia adecuada.
- Afeitarse la cabeza del ratón de la base del cráneo hasta la punta de la nariz usando las podadoras. Aplicar gel oftálmico a la af ratónterward para prevenir la ceguera del ratón.
- Cargar cada jeringa sobre el marco estereotáxico. Luego inclinar parte perpendicular de cada brazo del marco estereotáxico de manera que sean de 10 grados lejos de la normal. Asegúrese de que los brazos están inclinados, de tal manera que las agujas se enfrentan entre sí.
- Limpiar cada jeringa rellenando la aguja con 70% de etanol. Llene la aguja al menos tres veces para asegurar que la jeringa está limpio.
- Una vez que la aguja ha sido limpiado, enjuagar la aguja rellenando la aguja con doble H2O destilada Una vez enrojecida, llenar cada aguja con 1,3 l de doble H2O destilada Girar el émbolo de la jeringa para liberar 0,3 l de doble H destilada 2 O. Si el agua en la punta de la aguja, limpiando con cuidado el agua. Si nada sale de la jeringa, introduzca el émbolo completamente hacia abajo y luego repetir la limpieza de la jeringa.
- Después de llenar con agua, a continuación, tire hacia arriba de la jeringa llenar la jeringa con0,5 l de aire.
- Una vez que el aire y el agua están en la jeringa, llena con cuidado la jeringa con 1,3 l de solución de virus. En este punto asegurar que el volumen total de la jeringa es de 2,8 l. Una vez más girar la punta de la jeringa para liberar 0,3 l de virus. Si perlas de líquidos en la punta de la aguja, limpiando con cuidado el líquido. Si nada sale de la jeringa, introduzca el émbolo completamente hacia abajo y luego repetir la limpieza de la jeringa.
- Cirugía
- Coloque el ratón a la estructura estereotáxica, asegurándose de ajustar el marco estereotáxico para que el cráneo está nivelada y plana. Aplicar povodine-yodo al cuero cabelludo expuesto. El uso de un bisturí, hacer una incisión sagital en la línea media del cráneo dentro de la zona afeitada expuesto. A continuación, conecte las pinzas de bureta a la piel en el sitio de la incisión para asegurarse de que el cráneo permanece expuesta.
- Utilice H 2 O 2 a disolver el periostio para exponer las suturas de lacráneo. Ahora que el bregma y las suturas son visibles, asegúrese de ajustar el marco estereotáxico para asegurarse de que el cráneo es de nivel.
- Alinear las puntas de las agujas de las jeringas con el bregma y registrar las coordenadas de la bregma. Calcular las coordenadas de la donde se van a insertar las agujas.
- Para el plano rostral-Cauldal (RC), añadir 1,6 mm a las coordenadas grabadas bregma RC (+1,6 de bregma). Para el plano dorsal-ventral (DV), restar 2,4 mm a partir de las coordenadas bregma DV grabadas (-2,4 desde bregma).
- Por último, para el plano medial lateral (ML), añadir 2,6 mm a las coordenadas grabadas bregma ML (+2,6 de bregma). Para todas las coordenadas asegúrese de registrar las dos coordenadas izquierda y derecha, ya que esto es una inyección bilateral.
- Colocar las agujas las coordenadas deseadas. Marcar los lugares de donde se van a insertar y con un taladro, perforar las zonas marcadas las agujas.
- Con un aplicador con punta de algodón wipe la basura cualquier fragmento de sangre o de médula exceso.
- Colocar las agujas del cráneo, donde las puntas de las agujas están tocando la superficie del cerebro. Luego baje las agujas a las coordenadas deseadas lentamente disminución de los mismos.
- Una vez que las agujas están en las coordenadas deseadas, inyectar lentamente el contenido de la jeringa girando el émbolo de la aguja de 0,1 l por minuto en el transcurso de 5 min (en total 0,5 l).
- Una vez se ha realizado la inyección salir de la jeringa en la corteza durante otros 5 minutos.
- Hasta el cierre / Cuidado
- Retire las agujas de la corteza del ratón de manera constante y lentamente. A continuación, retire el ratón del marco estereotáxico.
- Aplicar cianoacrilato (adhesivo dérmico) a las aletas de base de la piel de la incisión y luego con unas pinzas agarran los colgajos de piel y los colocan juntos.
- Deje que el cianoacrilato se seque. Coloque el ratón en la jaula sobre un cojín eléctrico (resistencia de calentamiento es opcional si el surgsuite de iCal se mantiene bajo RT de 37 ° C - de otro modo no es necesario). Asegúrese de colocar el ratón sobre una toalla de papel para asegurarse de que la ropa de cama no se adhiere al sitio quirúrgico.
- Dependiendo de la duración del procedimiento quirúrgico, asegúrese de que los ratones está fuera de la anestesia en los 30 - 60 min después de la intervención. Después de la cirugía, el animal se coloca en su propia jaula y se controló hasta que se hace consciente antes de regresar a su habitación para recuperarse. No se utilizan analgésicos después de la operación, ya que pueden alterar los resultados de nuestros experimentos modificando algunas de las vías bioquímicas del cerebro. Sin embargo, los animales son monitoreados hasta que se recupere de la anestesia en el día de la cirugía, y todos los días después de la operación para detectar signos de infección y la evaluación del dolor / malestar.
Experimento 3. La cabeza de la contracción nerviosa de respuesta
- Preparar
- Llevar a cabo todas las pruebas de comportamiento 10 a.m.-02:00 de la tarde, 2 - 3 días después de stereotactic inyección de partículas virales.
- Disolver (±) -1- (2,5-dimetoxi-4-yodofenil) clorhidrato -2-aminopropano (DOI) en una solución salina al 0,9% a 2,0 mg / kg. También hay que preparar una solución salina al 0,9%.
- Preparar una jaula (28 x 18 x 15 cm) sin ningún tipo de ropa de cama y el uso de un trípode, ajuste la cámara para que el punto de vista de la cámara de vídeo está directamente encima de la jaula.
- Habituar los ratones a la habitación para hr al menos 4 antes del inicio del experimento.
- Configurar una cámara de vídeo para grabar la contracción cabeza.
- Experimentar
- Coloque la cámara de modo que se encuentra directamente sobre una jaula. Calibrar la cámara de modo que toda la jaula de alojamiento es en el campo de visión.
- Pesar ratón y ratón inyectar por vía intraperitoneal con dosis apropiada de cualquiera de 0,9% de solución salina o DOI (0.01 ml / g). NOTA: Si un ratón pesa 25 gramos, administrar dosis a un volumen total de 0,25 ml.
- Coloque cada ratón de nuevo en su jaula for 10 min. Después de 10 min, el lugar del ratón en el centro de la jaula de alojamiento vacío y validar que no hay puntos ciegos en el campo de visión de la cámara. Tecla de grabación de la videocámara. Dejar la habitación.
NOTA: Los movimientos del ratón y diversas respuestas de comportamiento en él (... Twitch cabeza, cero oído, etc Por favor, consulte la tabla de datos suplementarios 1 de González-Maeso et al 2007 para la lista completa de las respuestas de comportamiento inducidas por DOI) 3, se grabará durante 30 minutos. Por lo tanto, es importante que no hay puntos ciegos en el campo de visión registrado. - Después de 30 min detener la grabación de la videocámara y el lugar ratón de nuevo en la jaula hogar original. Repita este procedimiento para cada ratón.
- revisión
- Haga que cada árbitro opinión las cintas ciego a las condiciones experimentales de ratón (es decir., Fármacos utilizados durante la cabeza de contracción experimento o virus utilizado durante la inyección intracraneal)). registrar manualmente cada cabeza de contracción througHout el video.
NOTA: Cabeza de contracción se define como un movimiento de la cabeza sacudida rápida realizada por un ratón (vídeo complementario). - Para cada ratón, un promedio de la respuesta HTR final a partir de los tres totales de los árbitros ciegos. Entonces grupo de estos valores por condición experimental y llevar a cabo el análisis estadístico (es decir., T-test o ANOVA).
- Haga que cada árbitro opinión las cintas ciego a las condiciones experimentales de ratón (es decir., Fármacos utilizados durante la cabeza de contracción experimento o virus utilizado durante la inyección intracraneal)). registrar manualmente cada cabeza de contracción througHout el video.
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Representative Results
Resultados anteriores demuestran que la cabeza de contracción-respuesta conductual murino está provocada de forma fiable y robusta por alucinógenos, y es ausente en 5-HT 2A ratones -kō 3. Además, se ha demostrado que la respuesta de la cabeza de contracción provocada por los alucinógenos agonistas de 5-HT2A DOI y el LSD se redujo significativamente en los ratones KO mGlu2-5. Sin embargo, aunque los resultados anteriores demuestran convincentemente que 2A 5-HT y mGlu2 se ensamblan como un complejo heteromérico in vitro en células transfectadas 1,2,15, si esta disposición estructural se comporta como tal en ratones vivos quedado sin resolver. Para comprender plenamente el papel de la 5-HT 2A receptor heterocomplejo -mGlu2 en los efectos psicoactivos similares inducidos por alucinógenos agonistas de los receptores 5-HT 2A, la expresión de uno u otro mGlu2 o mGlu2ΔTM4N en la corteza frontal de ratones KO-mGlu2 examinar si esta manipulación regula el comportamiento.
Los ratones recibieron inyecciones intra corticales-frontal de HSV bicistrónico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) y, o bien mGlu2 o mGlu2ΔTM4N, o GFP solo. En primer lugar, se confirmó que el virus de la sobre-expresa mGlu2 o mGlu2ΔTM4N en la corteza frontal de ratón (Figuras 1A y 1B). Como se ha demostrado previamente 5, el comportamiento de la cabeza de contracción inducida por DOI estaba ausente en los ratones KO inyectados mGlu2-con el vector vacío HSV-GFP. En particular, la respuesta de la cabeza de contracción inducida por el alucinógeno agonista de 5-HT 2A DOI fue rescatado en ratones mGlu2-KO sobre-expresión de mGlu2, pero no mGlu2ΔTM4N, en la corteza frontal, en comparación a la observada en animales que expresan GFP (Figura 1C). En conjunto, estos resultados sugieren que el complejo receptor 2A -mGlu2 5-HT en el córtex frontal es fundamental para la regulación de los estados de tipo psicótico.
Figura 1. Expresión de mGlu2 como un receptor heterocomplejo. La expresión de mGlu2 como un receptor de 5-HT 2A es necesaria para un comportamiento de tipo psicótico inducido por drogas alucinógenas. (A) Imagen Representante de la expresión transgénica mediada por VHS en la corteza frontal. HSV-mGlu2, que también expresa GFP, se inyectó en la corteza frontal, y la expresión de GFP fue revelado por inmunocitoquímica, barra de escala, de 200 um. (B) HSV mediada por la expresión del transgen en la corteza frontal de ratones del ratón mGlu2-KO, y reactividad anti-mGlu2 se midió por transferencia Western. La especificidad del anticuerpo primario contra el receptor mGlu2 previamente se ha confirmado en los ratones knockout 6. receptores de glutamato metabotrópicos son GPCRs que forman homodímeros unidos covalentemente. Se midió la inmunorreactividad de mGlu2 como monómero (100 kDa) 6. (C et al (2012) 6. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario vídeo 1. Cabeza respuesta de contracción nerviosa. (Haga clic derecho para descargar). Ratones CD-1 WT fueron inyectados con 2,0 mg / kg DOI y se colocaron en una jaula (pared a oscuras entre las dos jaulas) para provocar la respuesta cabeza de contracción (comportamiento produce tras *).
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Discussion
Junto con los resultados anteriores en ratones mGlu2-KO 5, los resultados con mGlu2 y mGlu2 / mGlu3 construcciones quiméricas que no forman el complejo receptor 2A -mGlu2 5-HT en células cultivadas sugieren que el 2A 5-HT -mGlu2 complejo receptor heteroméricos en se necesita corteza frontal del ratón para inducir un comportamiento de contracción cabeza por alucinógenos agonistas de los receptores 5-HT 2A LSD. Una limitación de este método es que no mide la proximidad molecular de cerca a un nivel subcelular en el tejido nativo. Además, hay varios puntos críticos que se indique lo contrario. Debido a que los ratones se les inyecta un vector viral de HSV, el marco de tiempo que los experimentos que se realizan son 2 - 4 días después de la inyección. La ubicación y la expresión de los vectores virales deben ser verificados con la tinción de inmunofluorescencia de cerebro seccionada no más de 4 días después de la inyección inicial. Ratones en los que las coordenadas no coinciden o no expresar el vector viral debenser excluido de los datos experimentales, ya que no expresan la mGlu2 o mGlu2ΔTM4N. El cuidado después de la cirugía estereotáctica es también crucial, como un cierre defectuoso de la herida en la cabeza puede llevar a una infección que puede causar problemas tanto en los experimentos in vivo y la tinción de inmunofluorescencia. Por último, después de la inyección estereotáctica cualquier paradigma de comportamiento (. Campo abierto, alternando t-test, etc) se puede utilizar siempre que se encuentre dentro del 2-4 después de la inyección de las partículas virales. Una vez más, las coordenadas y de expresión deben ser confirmados por inmunofluorescencia.
El concepto de que la función de GPCRs como homo- y / o heterómeros en las células vivas está ahora bien establecida 16-18. Sin embargo, a pesar de algunos avances, se necesitan más estudios para definir el papel exacto (s) de complejos heteroméricos GPCR en modelos animales enteros 19. Enfoques como BRET y / o formación de imágenes FRET para investigar la proximidad física de proteína-proteína dentro de tejidos profundos de animales pequeñosmodelos pueden proporcionar medios para mejorar la comprensión del papel funcional de heterómeros GPCR en sujetos de 20 que vivían. El uso de la expresión mediada por HSV de los GPCR, ya sea nativo o con proteínas transmembrana modificados, proporcionar un modelo in vivo para evaluar la función y la interacción de los GPCRs.
También se necesitan más estudios en modelos de roedores para examinar la estabilidad y el tiempo de vida (formación y disociación) de heterómeros GPCR 21-23, reorganizaciones estructurales entre sus componentes 24, y el potencial de acoplamiento de proteína G después de la internalización del receptor 25,26. Dado el papel fundamental de los GPCRs en la señalización celular y la función, parece probable que esta área podría dar lugar a interesantes estudios básicos y de la traducción.
Aunque se requiere más investigación para caracterizar cuantitativamente la ultraestructural co-localización de ambos receptores en el SNC humano y de ratón, junto con Stu anteriortroqueles que demuestran convincentemente la electrofisiológico, celular, y las respuestas de comportamiento inducidos por alucinógenos en modelos de ratón son intrínsecos a 5-HT neuronas piramidales corticales que expresan el receptor 2A 3,27,28, los resultados obtenidos usando el enfoque de la expresión mediada por HSV descritos aquí sugieren es necesario que la formación heteromérica entre 2A y mGlu2 receptores 5-HT en el córtex frontal de ratón para el comportamiento de tipo psicótico cabeza de contracción inducida por el alucinógeno DOI 5-HT 2A agonista de los receptores.
MGlu2 expresión de HSV mediada, pero no mGlu2ΔTM4N, en las neuronas corticales frontales de los ratones KO-mGlu2 rescata el comportamiento de la cabeza de contracción inducida por el alucinógeno DOI 5-HT 2A agonista de los receptores. Esta herramienta de traducción podría ser ventajoso para los estudios preclínicos para evaluar fenotipos conductuales de heterómeros GPCR.
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Acknowledgments
NIH R01MH084894 participó en la financiación de este estudio. Nos gustaría agradecer a los Dres. Yasmin Hurd y Scott Russo en el Mount Sinai School of Medicine de la donación de los ratones y el uso de sus instalaciones de la cirugía y el comportamiento durante el rodaje de este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mGlu2 bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| mGlu2ΔTM4N bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| Xylazine | Lloyd | List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ketamine | Vedco | KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ophthalmic gel | Fisher Scientific | NC0550805 | |
| Burret clips | Fisher Scientific | NC9268369 | |
| Feather surgical blade | Fisher Scientific | NC9032736 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 19-898-919 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14815203 | |
| Hamilton™ Small Hub Removable Needles (33 Ga) | Fisher Scientific | 14816206 | |
| Cordless Micro Drill | Fisher Scientific | NC9089241 | |
| Dermabond Dermal Adhesive | Fisher Scientific | NC0690470 | |
| (±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI) | Sigma-Aldrich | 42203-78-1 | Dissolved in 0.9% saline solution to the concentration of 2.0 mg/kg |
References
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