Summary
Es sind Techniken beschrieben Phospho-Epitope in ganz Zebrafischembryonen zu Immunfärbung und dann leiten zweifarbige Leuchtstoff konfokalen Lokalisierung in zellularen Strukturen so klein wie primäre Zilien. Die Techniken zur Fixierung und Bildgebung können die Position und die Kinetik des Erscheinens oder Aktivierung spezifischer Proteine definieren.
Abstract
Die schnelle Proliferation von Zellen, die gewebespezifische Expression von Genen und die Entstehung von Signalisierungsnetze charakterisieren frühen embryonalen Entwicklung aller Wirbeltiere. Die Kinetik und die Lage der Signale - auch innerhalb einzelner Zellen - in den sich entwickelnden Embryo ergänzt die Identifizierung wichtiger Entwicklungsgene. Immunfärbung Techniken beschrieben, die die Kinetik der intrazellulären und ganzen Tier Signalen in Strukturen so klein wie primäre Zilien definieren abgebildet wurden. Die Techniken zur Fixierung, Imaging und Bearbeitung von Bildern mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskops verwendet, kann in nur 36 Stunden abgeschlossen sein.
Zebrafisch (Danio rerio) ist eine wünschenswerte Organismus für Forscher, die versuchen, Studien in einem Wirbeltierarten durchzuführen, die erschwinglich und relevant für die menschliche Krankheit. Genetic Knockouts oder Niederschlägen muss durch den Verlust der tatsächlichen Proteinprodukt bestätigt. Eine solche Bestätigung von Proteinverlustwerden können unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken erreicht. Clues der Signalwege kann auch durch Verwendung von Antikörpern entschlüsselt werden, der mit Proteinen reaktiv sind, die durch Phosphorylierung posttranslational modifiziert wurden. Die Erhaltung und die phosphorylierten Zustand eines Epitops Optimierung ist daher entscheidend für diese Bestimmung und wird von diesem Protokoll erreicht.
Diese Studie beschreibt Techniken Embryonen während der ersten 72 Stunden der Entwicklung und zu beheben eine Vielzahl von relevanten Epitope mit Zilien in das Vesikel (KV), die Nieren und das Innenohr des Kupffer co-lokalisieren. Diese Verfahren sind einfach, nicht Dissektion erforderlich und kann in einer relativ kurzen Zeitspanne abgeschlossen werden. Projizieren konfokale Bildstapel zu einem einzigen Bild ist ein nützliches Mittel, um diese Daten zu präsentieren.
Protocol
Der Zebrafisch Verfahren in diesem Protokoll wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Commonwealth University genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- 4% PFA / PBS. Wiegen 8 g Paraformaldehyd (PFA) in der Abzugshaube. Während noch in der Dunstabzugshaube, lösen sich die trockene PFA in ~ 80 ml destilliertem H 2 O unter Rühren und Erwärmen auf 50 ° C. Unter Rühren hinzufügen, 3-10 Tropfen frischer 1 N NaOH bis PFA vollständig gelöst ist und Lösung klärt. Vom Herd nehmen und mit 100 ml 2x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bringen Volumen auf 200 ml mit destilliertem H 2 O. Abkühlen auf RT und bestätigen pH-Wert von 7,4 vor dem Gebrauch. Lagerung im Dunkeln bei 4 ° C, aber verwenden innerhalb einer Woche.
- Verwenden Sie 100% Methanol ohne Ergänzungen. Verwenden Sie 95% Ethanol ohne Ergänzungen.
- Bereiten Phosphat-gepufferter Tween (PBT). Ergänzen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Tween-20. In 0.5 ml einer 20% igen Tween-20-Stammlösung zu 100 ml 1x PBS. Lagern bei RT.
- Bereiten phosphatgepufferter Triton-X (PBTx). Ergänzen PBS mit 0,1% Triton X-100. 0,5 ml einer 20% Triton X-100 Lager zu 100 ml PBS. Lagern bei RT.
- Bereiten Sie 10% NGS / PBTx. Normales Ziegenserum (NGS) blockiert unspezifische Bindungsstellen. Shop NGS bei -20 ° C. So verwenden, 1 ml bis 9 ml PBTx.
- Vorbereitung 50% Glycerin / PBS. Gründlich mischen zu gleichen Teilen aus 2x PBS und 100% Glycerin. Lagern bei RT.
2. Embryo Fixation
- . (. ZB β-Actin: CAAX-GFP) Abstammung Erhalten Wildtyp (AB und WIK) oder transgenen Embryos durch natürliche Paarungen. Falls gewünscht, injizieren Embryonen mit Konstrukten oder Morpholinos, wie beschrieben. 15,16
- Embryonen erhöhen. Sammeln Embryonen und Inkubation bei 28,5 ° C in Gegenwart von 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) Pigmentierung zu blockieren, wie beschrieben. 17 p>
- Fix. Wenn Embryonen den gewünschten Entwicklungsstadium erreicht haben, 18, betäuben die Embryonen mit MESAB, entfernen Sie so viel Wasser wie möglich System und fügen Sie frisch 4% PFA / PBS für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur. HINWEIS: In Zeiten von weniger als 20 Stunden nach der Befruchtung (HPF), fix vor dechorionation. Manchmal nach 20 HPF, dechorionate vor der Fixierung mit zwei Paaren von feinen Spitze einer Pinzette unter einem Binokular.
- Ändern Lösungen. Transfer-Embryonen eine breite Bohrung Pipette, wie beschrieben. 17 Lösungen wechseln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kappe bedeckt, einfach, indem Embryonen durch die Schwerkraft ohne Zentrifugation zu begleichen.
- Post-Fixierungs Nach 3 -. 4 Stunden, entfernen PFA / PBS, ersetzen mit 100% Methanol und bei -20 ° C für mindestens 48 Stunden. HINWEIS: Für maximale P-CaMK-II-Immunreaktivität, begrenzen Gesamt Methanol Lagerzeit bis zu einer Woche.
- Setzen Sie ein Minimum von 10 Embryonen für jede Versuchsbedingung in verschlossenen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und beschriften.
- Lassen Sie die Embryonen zu regeln. Entfernen und entsorgen Methanol und rehydratisieren mit progressiven wäscht mit 0,5 ml Ethanol-Konzentrationen abnimmt, wie im nächsten Schritt angegeben. Jeder Schritt ist ein 5 min Waschen mit Schaukel.
- Progressiv mit diesen 5 Lösungen rehydriert: 66% Ethanol / 33% PBTx, 33% Ethanol / 66% PBTx 100% PBTx 100% PBTx (dies ist die erste Wiederholung PBTx), 100% PBTx (dies ist die zweite Wiederholung von PBTx).
- Entfernen letzten PBTx waschen. 0,5 ml 10% NGS / PBTx. mindestens 1 Stunde bei RT inkubieren unter leichtem Schütteln und dann entfernen und Lösung verwerfen.
- Bereiten primären Antikörperlösung durch in 10% NGS / PBTx verdünnen. Wenn Co-Immunfärbung verwenden höhere Affinität Antikörper zuerst. 500: mit der Maus anti-acetylierten Antikörper Tubulin monoklonalen verdünnt 1 Für diese Studie inkubiert. für example, wenn 10 Proben sind, kombinieren 6 ul der Stammantikörperlösung mit 3 ml 10% NGS / PBTx und dann 0,3 ml davon in jedes Röhrchen verteilt.
- Hinzufügen 0,2-0,5 ml der verdünnten primären Antikörpers zu jedem Röhrchen alle Embryonen einzutauchen. Inkubieren unter leichtem O / N bei RT zu schaukeln.
- Am Morgen, zu entfernen und Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx überschüssigen primären Antikörpers weg zu waschen. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen.
- Dim Lampen oder verdünnen Sie den entsprechenden fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper in 10% NGS / PBTx so dass jeder Zustand mindestens 0,5 ml enthält. Mit der Maus-Anti-acetyliertes Tubulin primärer Antikörper, verwenden Sie die grün-fluoreszierenden Farbstoff Ziegen-Anti-Maus-IgG bei einer 1: 500-Verdünnung.
- Inkubieren sekundären Antikörper für 4 Stunden unter leichtem im Dunkeln bei RT Schaukel. Von nun an Verfahren die Proben unter gedämpftem Licht und in einem dunklen Behälter brüten oder in Alufolie wickeln.
- Am Ende der Inkubation entfernt und die sekundäre Antikörperlösung verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx zu waschen. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen.
- Wenn Co-Immunfärbung, erhalten den zweiten primären Antikörper von einer anderen Spezies als der ersten primären Antikörper. In diesen Studien, folgen Sie dem Kaninchen-Anti-phospho CaMK-II-Antikörper von der rot-fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörpers.
- Verdünnen Kaninchen-Anti-phospho CaMK-II-Antikörper 1.20. Für jedes Röhrchen von Embryonen, in 0,3 ml 10% NGS / PBTx aussetzen, dann 15 ul der Stammantikörperlösung hinzuzufügen.
- Stellen Sie sicher, dass Embryonen werden eingetaucht und Lichter gedimmt werden. Inkubieren unter leichtem O / N bei RT im Dunkeln zu schaukeln.
- Am Morgen unter der gedämpften Beleuchtung entfernen und Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen.
- Halten Overhead Lichter dimmen und verdünnen genug von dem entsprechenden fluoreszenz conjugated sekundären Antikörper, so dass jeder Zustand mindestens 0,5 ml. In dieser Studie wurden die verdünnten roten Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (roter Kanal) 1: 500 in 10% NGS / PBTx.
- Inkubieren zweiten sekundären Antikörper für 4 Stunden mit sanften im Dunkeln bei RT zu schaukeln.
- Am Ende dieser Inkubation und unter der gedämpften Beleuchtung ist zu entfernen und die sekundäre Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml PBTx. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen. Speicher in entweder PBTx oder 50% Glycerin / PBS in Abhängigkeit von dem Bildgebungsverfahren.
4. Die konfokale Fassung und -verarbeitung
- Berg Embryonen für die Bildgebung. Zeigen 1-5 Embryonen auf einem Glasträger. Erstellen einer Kammer zwischen dem Hauptdeckglas und dem Objektträger unter Verwendung von Deckglas-Fragmente auf jeder Seite der Kammer. Typischerweise werden vier # 1 Deckgläser verwendet, um diese Abstandshalter Stapel zu machen, ohne zu verkleben.
HINWEIS: Keine Montage Medium notwendig. - Verwenden Sie eine 100X ÖlimmersionZiel einzigen Embryo in den Fokus Durchlicht zu bringen. Schalten Sie Licht. Schalten Sie konfokalen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass geeignete Laser (grün und / oder rot) eingeschaltet sind und Remote-Fokus Mithelfer eingreift.
- Schalten Sie den konfokalen Programm. In der "Acquire Bar", die richtige Ziel wählen. In der "XY Basic" Bar, setzen die Bildgröße auf 1.024 von den 1.024 Button.
- In der "Laser und Detektor" Leiste klicken Sie auf den roten 488-Box und dem grünen 568 Feld Laser und Detektor für jeden Kanal zu schalten. Stellen Pinhole bis mittelgroß und passen Sie die Verstärkung in der "Gain" Bar jeder Kanal zu visualisieren.
- Im "Einstellungen Acquire" Leiste auf "Live" Erfassung von Bildern zu beginnen. In der "Einstellungen anzeigen" Bar, deaktivieren Sie die "Force Integral Zoom" Box-Center in der "Live" -Fenster.
- In der "Einstellungen abrufen" bar unter dem "Z" Registerkarte Schritt durch die Schichten des Bildes. Nach der Auswahl der number optischer Schnitte in das Bild zu übernehmen, in der "Mitte" der z-Ebene bis zu einem gewissen Punkt.
- Im Rahmen der "Z", klicken Sie das kleine rote "Reference" ein. Dadurch wird die RFA an dem Punkt Null, wenn die "Mitte" gewählt. Im Feld "Schrittweite" bezeichnet, wählen Sie die Dicke der Schichten (zwischen 0,25 & mgr; m und 2,0 & mgr; m ist ideal). Achten Sie auf das "File Size" ein und versuchen zu 1 GB zu begrenzen.
HINWEIS: In der Regel bis zu 40 optische Schnitte von 0,5 bis 1,0 & mgr; m erhalten werden, aber die Anzahl der Abschnitte können empirisch bestimmt werden. - Um die oben extreme des Bildes zu finden, klicken Sie auf den Kreis neben "Top" und bewegen sich durch die z-Schichten. Jetzt den Kreis klicken Sie neben "Unten", nimmt der Computer das Bild wieder in der Schicht als Zentrum. bewegen wieder durch die Schichten der unteren extremen des Bildes zu finden.
- Klicken Sie auf "Live" wieder in den "Einstellungen abrufen" Feld des Lasers zu stoppenErwerb. In diesem Fenster klicken Sie auf die roten Kisten etikettiert Durchschnitt und Z-Stapel. Diese Boxen wird grün.
- In der "Einstellungen abrufen" ein, klicken Sie auf "Single" das ganze Reihe von Bildern zu erwerben. Sie können den Fortschritt überwachen, da es in beiden Kanälen durchsucht und durch die gesamte Z-Stapel.
- Zu speichern, klicken Sie auf das Fenstervolumen und klicken Sie auf "Speichern unter" und den Dateinamen. Speichern als ".ids" -Datei. Um die Lautstärke zu machen, die Datei während der Z-Stapel noch geöffnet ist, wählen Sie das Menü Daten nach unten ziehen und klicken Sie auf "Volumen machen". Speichern Sie die gerenderte Datei als TIFF-Datei. Dies ist das projizierte Bild, das in dieser Veröffentlichung dargestellt sind.
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Representative Results
Optimale Bedingungen für die Visualisierung von Phospho-Epitope
Methoden, um die Immun von Protein-Epitope in Zebrafischembryonen beschrieben haben relativ spärlich gewesen im Vergleich zu denen für mRNAs über in-situ-Hybridisierung zu lokalisieren. Fixiermittel bei der Lokalisierung von Protein-Epitope in Geißelzellen des Zebrafischembryonen verwendet haben 4% PFA / PBS und Dent Fixierungsmittel enthalten, das eine Mischung aus Methanol und DMSO. 19 Lokalisierung von RNA durch ganze Berg in-situ-Hybridisierung (WISH) wird in der Regel unter Verwendung von PFA erreicht gefolgt von Lagerung in 100% Methanol. 20,21 Unsere Untersuchungen ergaben, dass der Wunsch Fixiermittel Kombination, wenn die Zeit in Methanol zwischen zwei bis sieben Tagen zu begrenzen, für Immun mit dem P-CaMK-II-Antikörper gegen jedes andere Fixiermittel weit überlegen war . Das Signal mit diesem PFA / Methanol Kombination erreicht war also deutlich größer als bei Dent-Fixativ 4% PFA / PBS oder Methanol allein verwendet wurden, in Abhängigkeit von der Entwicklungszeit und Lage innerhalb des Embryos.
Wenn die Technik der Optimierung verwendet hier und für jedes Fixiermittel und Entwicklungszeit beschrieben, wurde eine Kontrollprobe hergestellt, in denen alle Schritte wurden wiederholt, außer, dass der primäre Antikörper weggelassen wurde. Solche Kontrollproben fehlte ein Fluoreszenzsignal, wenn oben beschrieben unter den gleichen Bedingungen abgebildet. Diese Steuerung wird für andere Forscher empfohlen, diesen Ansatz mit jedem Antikörper zu replizieren.
Die PFA / Methanol Fixiermittel Kombination ergab das stärkste P-CaMK-II-Signal und war auch kompatibel mit Immunfärbung für acetyliertes Tubulin, die eine Standard-Marker für die Zilien ist. Entwicklungspolitisch ist die erste Wimper Organ, das auftaucht und hat in diesen Studien abgebildet wurde, ist die Vesikel der Kupffer (KV). Der KV ist am hinteren Ende der Chorda angeordnet, wie in der 12-Somiten (15 HPF) Stufe (Abbildung 1) gezeigt. Der KV ist eine vorübergehende Orgel und ist für Links-Rechts-Asymmetrie verantwortlich. Es zeigt sich in der 2-Somitenstufe (12 hpf) und verschwindet auf der ganzen 18-Somiten-Stadium. Beating primären Zilien eine kreisförmige Strömung der Flüssigkeit erzeugen, die in den 2+ Flimmerzellen zu einer Höhe von Ca führt die KV und die Aktivierung von CaMK-II in diskreten Stellen (Figur 1) auskleiden. P-CaMK-II Reaktivität erscheint und verschwindet auf der einen Seite des KV solange Zilien schlagen. 12 In diesem frühen Stadium, insgesamt embryonalen CaMK-II Niveau immer noch nur die Hälfte Niveau wie bei 24 HPF und ein Zehntel der Ebene nach 3 Tagen der Entwicklung. 11 Vielleicht weil insgesamt CaMK-II-Expression relativ niedrig bei 15 hpf ist, ist jede Verbesserung in der Immunfärbung Technik in dieser Phase besonders wichtig.
between 24 und 72 hpf der Entwicklung erscheint P-CaMK-II auf der apikalen Oberfläche von Flimmerzellen spezifischen Regionen des pronephric Kanäle (Figuren 2,3) auskleiden. Die Immunreaktivität der gesamten II-CaMK entlang der gesamten pronephric Kanal und in benachbarten Somiten (Abbildung 2) zeigt, dass nur eine Teilmenge von embryonalen II CaMK-aktiviert (P-II-CaMK).
Fixation Bedingungen sind kompatibel zu bewahren GFP-Fluoreszenz
Diese Befestigungstechniken sind auch kompatibel mit Halte grün fluoreszierende Protein (GFP) Fluoreszenz ohne Vergrößerung (Abbildung 3). In der GFP-markierten CaMK-II-Konstrukt, das es in dieser Figur verwendet wird, behält GFP ausreichende Fluoreszenz obwohl PFA / Methanol Fixierung und anschließende Immunfärbung. In einem hohen Vergrößerungsansicht Zellen entlang der pronephric Kanal (3), THe mosaic Expression von GFP-CaMK-II kann in Zellen betrachtet werden, die auch für P-CaMK-II immungefärbt wurden.
Der Zebrafisch embryonalen Ohr ist ein anderes Gewebe, in dem die Erhebung von Ca 2+, handelnd durch CaMK-II, beeinflusst seine Entwicklung. 14 Zebrafisch Ohren normalerweise bei etwa einem Tag der Entwicklung erscheinen. Zu dieser Zeit wird intensiv CaMK-II an der Basis der Kinozilien aktiviert und auf den unteren Ebenen entlang der Kinozilium (Abbildung 4). Dieser Satz von Bildern zeigt, dass diese Fixierung und Immun Technik innerhalb Zilien erkennen Färbung, eine Struktur, deren Querschnitt kleiner ist als 1 um. Diese Wimpern behalten ihre Struktur in dieser Fixierung und Immunfärbung Prozess.
Ein zusätzliches Beispiel für Zweifarben-Gegenfärbung im Innenohr zu einem späteren Zeitpunkt der Entwicklung wurde sowohl mit Alexa durch Beizung 488Phalloidin und anti-acetyliertes Tubulin gefolgt von einem Alexa 568 markierten sekundären Antikörper (Abbildung 5). Es ist bemerkenswert, dass die PFA / Methanol Fixierungsmethode bewahrt sowohl F-Actin und Tubulin, die nicht bei allen Fixiermittel ist. In diesem Beispiel wird als zusammengeführte Farbbild für die gesamte Ohr gezeigt und dann für Teilbereiche. 14
Eine abschließende repräsentatives Beispiel für Zweifarben-Gegenfärbung wurde mit einem Stamm von Fisch erreicht, die Embryonen mit membran gezielte GFP (Figur 6) erzeugt. Membran gezielt GFP ist nicht auf einen anderen Protein gebunden und geht verloren, wenn mit Methanol extrahiert, daher wurde dieses Bild aus Fisch erhalten, das allein mit PFA fixiert waren. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Behandlung Methanol extrahiert Membranen, so dass es nicht für Proteine, die ausschließlich empfohlen gebunden Membran sein kann. Der P-CaMK-II-Signal in dieser Figur verringert wird relativ zu dieser erreicht, wenn Methanol wurden ebenfalls verwendet, aber dies zeigt, daß zu diesem Zeitpunkt und Ort (Niere) des sich entwickelnden Embryos, das Signal stark genug ist, um ohne Methanolbehandlung erkannt werden. Das ist bei der KV Bühne nicht wahr,. Dh Methanol benötigt P-CaMK-II-Immunfärbung sichtbar zu machen. Dieses Beispiel ist nur als zusammengefügte Bild gezeigt, wo die pronephric Kanal der Niere zu Rumpfmuskulatur angrenzt.
Zusammenfassend beschriebene PFA / Methanol Fixierungsverfahren hier ist kompatibel mit der Erhaltung der GFP und Färbung für F-Aktin, acetylierte Tubulin gesamt CaMK-II und P-CaMK-II.
Abbildung 1. P-CaMK-II gegengefärbt für Acetylated Tubulin (Zilien) in Zebrafisch-KV. Ansichten eines einzigen Live 12 somite Stufe (12 ss) Embryo zeigt die hintere Position des KV durch die arrowhead (Seitenansicht, A) und der Kreis innerhalb des Feldes (ventrale Ansicht, B). Embryonen in diesem Stadium wurden PFA / Methanol fixiert werden. Die Embryonen wurden für acetyliertes Tubulin, gefolgt von einem Alexa 488 markiertem Sekundärantikörper (Grünkanal) immun. Als nächstes wurde die polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen P-CaMK-II durch einen Alexa 568-markierten sekundären Antikörper (roter Kanal) gefolgt. Zweikanal-Fluoreszenzbildprojektionen wurden als bei zunehmend höheren Vergrößerungen (C, D) beschrieben erworben. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Diese Zahl wird von einer früheren Veröffentlichung geändert. 12 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. P-CaMK-II gegengefärbt fürInsgesamt CaMK-II entlang Zebrafisch Niere. Eine einzige dechorionated Embryo bei 30 HPF wurde mit festen PFA / Methanol. Embryos wurden dann gefärbt Gesamt CaMK-II durch die Alexa 488 gefolgt markierten sekundären Antikörper (grün). Als nächstes wurde die P-CaMK-II primären Antikörpers durch den sekundären Antikörper (rot) markiert 568 Alexa gefolgt. Färbung zeigt eine Anreicherung von Aktiv CaMK-II (in rot) entlang der apikalen Oberfläche von Zellen, die die Kanäle des pronephric Zebrafisch Niere während insgesamt CaMK-II Linie an der Somiten Grenzen benachbarter Muskelgewebe angereichert ist und während Sarkomeren. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Diese Bilder wurden bei einer niedrigeren Vergrßerung erworben als im Text beschrieben, um, um die gesamte Niere zu visualisieren. Diese Zahl wird von einer früheren Veröffentlichung geändert. 13 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. P-CaMK-II Zähler abgebildet für GFP in Zebrafisch-Nierenzellen. Diese 30 HPF Embryo wurde mit einer cDNA, die eine dominant negative GFP-CaMK-II eingespritzt. 13 Eine solche Injektionen zeigen typischerweise Mosaik Ausdruck. Der Embryo wurde mit PFA / Methanol fixiert und immun dann für P-CaMK-II eine Alexa 568 markierte sekundäre Antikörper verwendet. Imaging zeigt, dass GFP hält über den PFA / Methanol Fixierung, Rehydrierung, Sperrung und Immunfärbung. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Diese Zahl wird von einer früheren Veröffentlichung geändert. 13 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 P-CaMK-II gegengefärbt mit Acetylated Tubulin in Zebrafisch-Innenohr. Diese 30 HPF Embryo wurde mit PFA / Methanol fixiert. Die anti-acetylierte Tubulin-Antikörper wurde, um durch die Alexa 488 -markiertem Sekundärantikörpers, der P-CaMK-II Antikörper und dem Alexa 568 markierten sekundären Antikörpers gefolgt. Die Färbung zeigt, dass P-CaMK-II entlang Innenohr Cilien vorhanden ist, und Co-lokalisiert mit acetylierten Tubulin. Maßstabsbalken = 5 um. Diese Zahl wird von einer früheren Veröffentlichung geändert. 14 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Actin und Acetylated Tubulin in Zebrafisch-Innenohr. Ein Drei Tage alten (72 HPF) Zebrafischembryo wurde fixiert und immun für acetylierte tAlexa 568 -markierten sekundären Antikörper, gefolgt von Aktin-Visualisierung mit Alexa 488 Phalloidin ubulin verwenden. Cilia sowie axonalen Innervation des Ohres wird durch acetyliertes Tubulin (rot) aufgedeckt und F-Actin-Strukturen umfassen Muskelfasern (in grün). die vordere Makula (am) und posterioren Crista (pc): Zwei Wimper sensorischen Regionen des Zebrafisch-Ohr werden ausführlicher gezeigt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Diese Zahl wird von einer früheren Veröffentlichung geändert. 14 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. 6 P-CaMK-II Zähler abgebildet für Membran GFP in Zebrafisch-Kidney Diese einzelne Mischbild, in dem die β-Aktin. CAAX-GFP Embryo (30 HPF) wurde fixiert und gefärbt für P-CaMK-II, gefolgt von der Alexa 568 markierte sekundäre Antikörper. Färbung zeigt eine Anreicherung von Aktiv CaMK-II (in rot) entlang der apikalen Oberfläche von Zellen, die die Kanäle des pronephric Zebrafisch Nierenlinie. Diese Niere Gangzellen sind eingebettet knapp unterhalb Muskelgewebe und beide werden durch die Expression von Membran gezielt GFP (grün) markiert. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die PFA / Methanol-Verfahren wurde in diesem Labor mit dem vorrangigen Ziel der Optimierung der Immun des Phospho-T 287 -CaMK-II-Epitop während Zebrabärblingentwicklung entwickelt. Diese Methode erfolgreich P-CaMK-II bei der Bildung von mehreren ciliated Organe, einschließlich Zebrafisch KV, 12 Innenohr 14 und Niere. 13 besonders am KV Stufe diese Technik notwendig war, lokalisiert. Der Erfolg dieses Verfahrens ist wahrscheinlich auf eine Kombination von a) Minimierung von Autofluoreszenz, b) Erhaltung des phospho-CaMK-II-Epitop und c) verbesserte Zugänglichkeit des Epitops an Antikörper.
Eine primäre Beschränkung dieses Ansatzes ist die Lagerzeit in Methanol. Während Immunreaktivität von P-CaMK-II nach zwei Tagen in Methanol bei -20 ° C maximal ist, wird die Reaktivität dieses Epitop nach einwöchiger Lagerung in Methanol verloren. Es ist nicht klar, ob die Phosphatgruppe zu diesem Zeitpunkt hydrolyzed oder weitere Denaturierung auftritt, Immunreaktivität abnimmt. Methanol / EGTA bei -20 ° C ist ein traditionell schnelle Fixiermittel für bei der Entwicklung von frühen Embryonen Tubulin-reichen Strukturen erhalten bleiben. 22 jedoch Methanol allein nicht wünschenswert ist für die Erhaltung der Morphologie oder auch Strukturen wie das Aktin-Zytoskelett und voranzustellen PFA.
Weitere Vorteile dieses Ansatzes sind, dass es auch andere Epitope wie F-Actin und acetyliertes Tubulin bewahrt und nicht die native Fluoreszenz von GFP beseitigen. Andere Fixiermittel, wie Dent Fixierungsmittel, überlegen sind für andere Epitope 13 und weiterhin mit dem P-CaMK-II-Färbung, obwohl P-CaMK-II-Färbung Fixiermittel ist schwächer in Dent als PFA / Methanol. Seit Phospho-Proteine in Signalwegen verbreitet sind, die während der frühen Entwicklung tätig sind, Dent Fixiermittel und PFA / Methanol als zwei Fixiermittel für andere Phospho-Epitope in zeb empfohlenrafish Embryonen. In Anwendungen mit dieser Technik für andere Proteine und ihre Antikörper zu entwickeln, war es hilfreich waren Antikörper zu haben, die auf Immunblots auch reaktiv sind und an Proteine sind kloniert und überexprimiert, mit dem Antikörper überprüft werden kann. 12
Es ist der Mühe wert, um Techniken für Immun optimieren, weil es a) Gen Unterdrückung auf Proteinebene überprüfen können und b) ermöglicht die Entwicklung von Modellen für die Aktion. In diesem Labor haben die Ergebnisse dieser Assays, die die Formulierung von Modellen durch die CaMK-II-Funktionen erlaubt. Beispielsweise ist die Lage in der KV vorübergehend und asymmetrisch, wie die Rolle dieses Organs. In der Niere, schlägt seine Lage auf der apikalen Seite der pronephric duktalen Zellen Rollen, die auf Signale aus dem Kanal reagieren. Schließlich schlägt die Aktivierung dieses Enzyms in spezifische intensive puncta an der Basis des Ohrs Kinozilien eine lokalisierte Ca 2+ -Signal. Die hier beschriebenen Methodensollte auch auf jeden Ermittler sinnvoll sein, die hochauflösende Bilder von jedem embryonalen Zelltyp in zwei Fluoreszenzkanäle zu erhalten sucht.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Grant IOS-0817658 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
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