Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Abstract

hücrelerin hızlı çoğalması, gen dokuya özgü sentezleme ve sinyal ağlar ortaya tüm omurgalıların, erken dönemde embriyo gelişimi karakterize eder. hatta tek hücrelerin içinde - - kinetik ve sinyallerin yeri gelişmekte olan embriyonun önemli gelişimsel genlerin belirlenmesi tamamlar. Immün teknikleri primer kirpikler kadar küçük yapılarda, hücre içi ve bütün hayvan sinyallerinin kinetiklerini belirlemek için gösterilmiştir ki açıklanmaktadır. bir lazer tarama konfokal bileşik mikroskop kullanılarak sabitleme, görüntüleme ve işleme görüntüler için teknikler kadar az 36 olarak saat içinde tamamlanabilir.

Zebra balığı (Danio rerio) ekonomik ve insan hastalığı ile ilgili bir omurgalı türlerinde çalışmalar yapmak istiyoruz araştırmacılar için bir arzu organizmadır. Genetik tırnakları veya knockdowns gerçek protein ürününün kaybı ile teyit edilmesi gerekir. protein kaybı Böyle onayBurada tarif edilen teknikler kullanılarak elde edilebilir. sinyal yolları içine ipuçları da çeviri sonrası fosforilasyon ile modifiye edilmiş protein ile reaktif olan antikorlar kullanılarak deşifre edilebilir. Korunması ve bir epitopun fosforile durumunu optimize bu belirleme için kritik öneme sahiptir ve bu protokol ile gerçekleştirilir.

Bu çalışma geliştirme ve ilk 72 saat boyunca embriyolar düzeltmek için teknikler anlatılmaktadır Kupffer en veziküllü (KV) 'de cilia ile ilgili epitopların çeşitli böbrek ve iç kulak co-lokalize. Bu teknikler diseksiyon gerekmez, basit ve zaman görece kısa bir süre içinde tamamlanabilir. tek bir görüntü içine konfokal görüntü yığınlarının Projelendirme bu verileri sunma yararlı bir araçtır.

Protocol

Bu protokol zebrabalıkları prosedürler Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Reaktiflerin 1. Hazırlık

  1. % 4 PFA / PBS ile yıkandı. davlumbaz paraformaldehit 8 g (PFA) tartılır. Hala davlumbaz, ~ 80 ml ​​50 ° C, karıştırma ve ısıtma ile damıtılmış H2O kuru PFA çözülür ise. PFA tamamen çözülene ve çözelti açıklık kadar taze 1 N NaOH 10 damla - karıştırılırken, 3 ekleyin. Ateşten ve 100 ml 2x fosfat tamponlu tuz (PBS) ilave edin. Damıtılmış H2O 200 ml hacim getirmek Oda sıcaklığına soğutun ve kullanımdan önce 7.4 pH teyit etmektedir. 4 ° C de karanlıkta deposu ancak bir hafta içinde kullanın.
  2. herhangi bir ek olmadan% 100 metanol kullanın. herhangi bir ek olmadan% 95 etanol kullanın.
  3. Fosfat tamponlu Tween (PBT) hazırlayın. % 0.1 Tween-20 ile fosfat tamponlu tuz (PBS) Supplement. 0 ekleyin.PBS 1X 100 ml% 20 Tween-20 stok çözeltisi 5 mi. Oda sıcaklığında saklayın.
  4. Fosfat tamponlu Triton-X (PBTx) hazırlayın. % 0.1 Triton X-100 ile PBS Supplement. PBS, 100 ml bir% 20 Triton X-100 stokunun 0.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında saklayın.
  5. % 10 NGS / PBTx hazırlayın. Normal keçi serumu (NGS) blok spesifik olmayan bağlanma siteleri. -20 ° C'de parçalar halinde saklayın NGS. Kullanmak 9 ml PBTx 1 ml ekleyin.
  6. % 50 gliserol / PBS hazırlayın. 2x PBS ve% 100 gliserol iyice eşit parçaya karıştırın. Oda sıcaklığında saklayın.

2. Embriyo Sabitleme

  1. . (., Örneğin β-aktin: CAAX-GFP) Damızlık elde vahşi tip (AB ve WIK) veya transgenik doğal çiftleşmelerin aracılığıyla embriyolar. İstenirse açıklandığı gibi, yapıları veya morpholinos ile embriyolar enjekte edilir. 15,16
  2. . Embriyolar kaldırın embriyolar toplayın ve tarif edildiği gibi pigmentasyon engellemek için% 0.003 1-fenil-2-tioüre (PTU) mevcudiyetinde 28.5 ° C'de inkübe edin. 17 p>
  3. Embriyolar istenilen gelişim aşamasına, 18 ulaştığında. Fix,   , MESAB kullanılarak embriyolar anestezi mümkün olduğu kadar sistem, suyu buharlaştırmak ve 3 taze% 4 PFA / PBS ekleyin - oda sıcaklığında 4 saat. NOT: 20 saat sonra döllenme (hpf) daha az zamanlarda, dechorionation önce düzeltin. 20 hpf sonra zaman zaman, bir mikroskop altında ince nokta forseps iki çift kullanarak fiksasyon önce dechorionate.
  4. Çözümler değiştirme. Geniş bir delik pipet kullanarak embriyoların transferi, tarif edildiği gibi. Mikrosantrifüj tüpleri şapkalı 1.5 ml 17 Değişim çözümleri, sadece embriyolar santrifüj olmadan yerçekimi ile yerleşmek için izin vererek.
  5. Sonrası sabitleyici sonra 3 -. 4 saat, en az 48 saat boyunca -20 ° C'de% 100 metanol ve mağaza ile yerine, PFA / PBS kaldırmak. NOT: maksimal P-CAMK-II immünoreaktivitesinde için, bir hafta toplam metanol saklama süresini sınırlamak.
"> 3. Immün Tüm Embriyolar

  1. başlıklı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her deneysel koşul için 10 embriyo az yerleştirin ve etiketlemek.
  2. embriyolar yerleşmek için izin verin. Çıkarın ve metanol atmak ve bir sonraki aşamada gösterildiği gibi, etanol ve azalan konsantrasyonlarda 0.5 ml ihtiva eden aşamalı yıkama ile rehidrate. Her adım sallanan bir 5 dk yıkama olduğunu.
  3. Kademeli bu 5 çözümleri ile rehydrate:% 66 etanol /% 33 PBTx,% 33 etanol / PBTx,% 100 PBTx,% 100 PBTx (bu PBTx ilk tekrarıdır),% 100 PBTx (bu ikinci tekrarı ise% 66 PBTx).
  4. Geçen PBTx yıkama çıkarın. 0.5 ml% 10 NGS / PBTx ekleyin. hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca inkübe edilir ve akabinde çıkarın ve solüsyonu atın.
  5. % 10 NGS / PBTx içinde seyreltilmesi birincil antikor çözüm hazırlayın. CO-immün, önce yüksek afinite antikor kullanımı. 500: Bu çalışma için, 1 seyreltilmiş fare anti-asetile tübülin monoklonal antikor ile inkübe edin. exampl içinE, 10 numune,% 10 NGS / PBTx 3 ml stok antikor çözeltisi 6 ul birleştirilir ve daha sonra, her tüpe, bu, 0.3 ml dağıtmak varsa.
  6. Tüm embriyo sokmak için her bir tüpe seyreltilmiş birincil antikor 0.5 ml - 0.2 ekleyin. Oda sıcaklığında nazik sallanan O / N ile kuluçkaya yatmaktadır.
  7. Sabah, kaldırmak ve antikor çözüm atın. Fazla birincil antikor yıkayacak 0.5 ml% 2 NGS / PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın.
  8. tepe ışıkları Dim ve her bir durum, en azından 0.5 ml içerir, böylece% 10 NGS / PBTx uygun floresan-konjuge sekonder antikor seyreltin. : 500 oranında seyreltilmiş fare anti-asetillenmiş tübülin birincil antikor ile, 1 yeşil fluoresan boya keçi anti-fare IgG kullanın.
  9. yumuşak karanlıkta oda sıcaklığında çalkalanarak 4 saat sekonder antikoru inkübe edin. silik ışıkları altında ve karanlık bir kapta inkübe veya alüminyum folyo ile sararak numuneler süreç, şu andan itibaren.
  10. İnkübasyonun sonunda, kaldırma ve ikincil antikor solüsyonu atın. 0.5 ml% 2 NGS / PBTx yıkamak ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın.
  11. CO-immün, önce birincil antikor daha farklı bir türden gelen ikinci birincil antikor elde edilir. Bu çalışmalarda, kırmızı fluoresan boya-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor tavşan anti-fosfo CAMK-II antikoru izleyin.
  12. tavşan anti-fosfo CAMK-II antikoru 01:20 sulandırmak. Embriyoların her bir tüp için, daha sonra, 0.3 ml% 10 NGS / PBTx askıya hazır antikor çözeltisi 15 ul ekle.
  13. Embriyolar dalmış ve ışıkları sönük olduğundan emin olun. karanlıkta oda sıcaklığında hafif sallanan O / N ile kuluçkaya yatmaktadır.
  14. loş ışıklar altında Sabah, kaldırmak ve antikor çözüm atın. 0.5 ml% 2 NGS / PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın.
  15. loş havai ışıkları tutmak ve uygun floresan konjugat yeterince sulandırmakkapı ikincil antikor, böylece her koşul en az 0.5 ml içerir. 500,% 10 NGS / PBTx: Bu çalışmada, kırmızı fluoresan boya-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor (kırmızı kanal) 1 seyreltin.
  16. yumuşak karanlıkta oda sıcaklığında çalkalanarak 4 saat, ikinci ikincil antikor inkübe edin.
  17. Bu inkübasyon ve loş ışıkları altında sonunda, kaldırmak ve ikincil antikor çözüm atın. 0.5 mi PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın. Mağaza PBTx ya da% 50 gliserol / PBS ya görüntüleme işlemi bağlı olarak değişir.

4. Konfokal Görüntüleme ve İşleme

  1. Dağı görüntüleme için embriyolar. Bir bardak slayt 5 embriyo - 1 yerleştirin. Ana lamel ve odanın her iki tarafında lamel fragmanları kullanılarak kızak arasında bir bölme oluşturur. Tipik olarak, dört 1. lamelleri sızdırmazlık olmadan bu boşluk yığınları yapmak için kullanılır.
    NOT: Hiçbir montaj orta gereklidir.
  2. Bir 100X yağ daldırma kullanınAmaç iletilen ışık kullanarak odak noktası haline tek embriyo getirmek. Işığı kapatın. konfokal mikroskop açın. Bu uygun lazerler (yeşil ve / veya kırmızı) açık ve uzaktan odak accessary oturduğundan emin olun.
  3. konfokal programı açın. In "Edinme bar," Doğru hedefi seçin. "XY Temel" çubuğunda, 1.024 butonuna tıklayarak 1.024 görüntü boyutunu ayarlayın.
  4. "Lazer ve Dedektörü" barda, her kanal için lazer ve dedektör açmak için kırmızı 488 kutu ve yeşil 568 kutusuna tıklayın. orta iğne deliği ayarlayın ve görselleştirmek için her kanalın "Kazanç" barda kazancını ayarlayın.
  5. "Elde Ayarlar" çubuğunda, görüntüleri elde başlamak için "Canlı" seçeneğine tıklayın. "Görünüm Ayarları" çubuğunda, "Canlı" penceresinde merkezine "İntegral Yakınlaştırma zorla" kutusunun işaretini kaldırın.
  6. "Ayarlar Edinme" barda "Z" sekmesi altında, görüntünün katmanları üzerinden adım. nu seçtikten sonraOptik bölümden mber, görüntü içine dahil z-düzlemi "Merkezi" bazı noktaya taşımak için.
  7. "Z" sekmesi altında, küçük kırmızı "Referans" kutusuna tıklayın. Bu "merkez" olarak seçilen noktada RFA sıfır olacaktır. "Adım Boyutu" etiketli kutuda (ideal mikron mikron 0.25 ila 2.0) katmanların kalınlığı seçin. "Dosya Boyutu" kutusuna dikkat edin ve 1GB sınırlamak için deneyin.
    Not: Genellikle, 0.5, 40, optik bölüme kadar - 1.0 um elde edilir, ancak bölme sayısı deneysel olarak tespit edilebilir.
  8. Resmin üst extreme bulmak için, "Top" yanındaki daireyi tıklayın ve z katmanları arasında hareket. Şimdi, bir sonraki "Bottom" için daireyi tıklayın bilgisayar merkezi olarak katmana geri görüntü alacaktır. Yine resmin alt aşırı bulmak için katmanları arasında hareket.
  9. lazer durdurmak için kutu "Edinme Ayarlar" tekrar "Canlı" linkine tıklayınedinimi. Bu panelde, kırmızı Ortalama etiketli kutuları ve Z-yığını tıklayın. Bu kutular yeşile döner.
  10. "Elde Ayarlar" kutusunda, görüntülerin tüm seriyi kazanmak için "Single" tıklayın. her iki kanalda ve tüm z-yığın içinde tarar gibi ilerlemesini izleyebilirsiniz.
  11. Kaydetmek birimi penceresinde tıklayın ve tıklayın "farklı kaydet" ve dosyayı adlandırın. Bir ".ids" dosyası olarak kaydedin. hacmine z yığın açıkken, dosyayı işlemek Veri menüyü aşağı çekin ve "render hacim" linkine tıklayarak seçin. Bir tiff dosyası olarak verilen dosyayı kaydedin. Bu, ilgili yayının gösterilmiştir yansıtılan görüntüdür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fosfo-epitopları görselleştirme için en uygun koşulları

Zebra balığı embriyolarının protein epitoplarının bağışık anlatan Yöntem in situ melezleme yoluyla mRNA'ların lokalize için kıyasla nispeten seyrek olmuştur. Zebra balığı embriyoların silli hücrelerde protein epitoplarının lokalize kullanılan Fiksatifler% 4 PFA / PBS ve metanol ve in situ hibridizasyon bütün montaj ile RNA DMSO ilave edin. 19 yerleşim (DİLERİZ) 'in bir karışımı olan Dent fiksatif dahil olan tipik olarak PFA kullanılarak elde edilir % 100 metanol depolama eklenmiştir. 20,21 Çalışmalarımız, iki ila yedi gün için metanol içinde süresinin kısaltılması sırasında DİLERİZ sabitleyici bileşimi, p-CAMK II antikoru ile bağışık için başka bir sabitleyici çok daha üstün olduğunu ortaya koydu . Bu PFA / metanol kombinasyonu ile elde sinyal oldu also Dent sabitleyici,% 4 PFA / PBS veya metanol embriyo içinde gelişimsel zaman ve yere bağlı olarak, tek başına kullanıldığı zaman önemli ölçüde daha büyük.

burada kullanılan her tespit edici ve gelişim süresi için tarif edilen teknik optimize ederken, bir kontrol numunesi birincil antikor tamamen gözardı edilmesi hariç, burada tüm adımları izlenmiştir hazırlanmıştır. Yukarıda tarif edilen aynı koşullar altında görüntülenmiş Böyle kontrol numuneleri bir flüoresan sinyal yoktu. Bu kontrol bir antikor ile bu yaklaşımı çoğaltma diğer araştırmacılar için önerilir.

PFA / metanol sabitleştirici kombinasyonu güçlü P-CAMK-II sinyalini verdi ve aynı zamanda kirpikler için standart bir belirtecidir asetillenmiş tubulin için immün ile uyumlu idi. çıkar ve bu çalışmalarda görüntülenmiştir edilmiştir Gelişimsel, ilk kirpikli organı Kupffer en vezikül (KV) 'dir. 12-hücre gruplarının (15 HPF) aşama (Şekil 1) gösterildiği gibi KV Notokordun arka ucunda yer alır. KV geçici bir organdır ve sol-sağ asimetri sorumludur. Bu 2-hücre gruplarının sahne (12 hpf) ortaya çıkmaktadır ve 18-hücre gruplarının sahne etrafında kaybolur. Dayak primer kirpikler KV ve ayrı konumlarda CAMK-II ile aktivasyonunu (Şekil 1) astar silli hücrelerde Ca + 2 bir artışa yol açar sıvının dairesel akım oluşturur. P CAMK II reaktivite, toplam embriyonik CAMK II seviyeleri hala sadece yarısı 24 hpf olarak düzeyi ve seviye onda biri olan görünür ve bu erken aşamada sürece kirpikler yenerek gibidir. 12 KV bir tarafında kaybolur Toplam CAMK-II ekspresyonu 15 HPF nispeten düşük olduğundan, gelişme 3 gün. 11 belki de, bu aşamada immün tekniğinde bir gelişme önemlidir.

betwegelişme 24 ve 72 hpf tr P-CAMK-II Pronephric kanalların (Şekil 2,3) belirli bölgelerini kaplayan siliyalı hücrelerinin apikal yüzeyinde görünür. (Şekil 2) tüm Pronephric kanal boyunca ve komşu Somitlerin boyunca toplam CAMK-II immünoreaktivitesi embriyonik CAMK-II yalnızca bir alt kümesini (P-CAMK-II) devrede olduğunu göstermektedir.

Tespit Koşullar GFP Floresan koruma ile uyumlu olan

Bu tespit teknikleri de geliştirme olmadan (Şekil 3) yeşil flüoresan protein (GFP) floresan tutucu ile uyumludur. GFP etiketli CAMK-II bu şekilde kullanılır inşa GFP yeterli floresan PFA / metanol tespit ve takip eden immün olsa korur. Pronephric kanalını çevreleyen hücreler arasında yüksek bir büyütme görünümünde (Şekil 3), inciGFP-CAMK-II 'nin E mozaik ifadesi, P-CAMK-II için boyanmış olan hücrelerde görüntülenebilir.

Zebra balığı embriyonik kulak Ca 2+ yükseklik, CAMK-II aracılığıyla hareket ederek gelişimini etkileyen bir başka dokudur. 14 Zebra balığı kulakları normal gelişim yaklaşık bir gün görünür. Şu anda, CAMK II yoğun kinocilia tabanında ve kinocilium (Şekil 4) boyunca düşük düzeylerde aktive edilir. Görüntülerin Bu seti bu tespit ve bağışık tekniği kirpikler içinde boyama algılayabilir gösterir, kimin kesit bir yapı en az 1 mm. Bu kirpikler bu tespit ve immün süreci boyunca yapılarını korurlar.

Gelişme, daha sonra, iç kulakta iki renkli counterstaining bir başka örnek, Alexa 488, her iki ile boyama ile elde edilmiştirfaloidin ve Alexa 568 takiben anti-asetillenmiş tubulin ikincil antikor (Şekil 5) etiketledi. PFA / metanol tespit yöntemi tüm fiksatiflerin doğru değil, hem F-aktin ve tubulin, korur dikkat çekicidir. Bu örnek, tüm kulağa birleştirilmiş renkli görüntü olarak ve daha sonra alt bölge için gösterilmiştir. 14

İki renkli counterstaining son bir temsili bir örneği, membran-hedefli GFP (Şekil 6) ile embriyolar üretilen balık suşundan elde edilmiştir. Membran hedeflenen GFP başka proteine ​​bağlı değildir ve bu yüzden, bu görüntü, tek başına PFA ile tespit edildi balıktan elde edildi, metanol ile ekstre kaybolur. Bu sonuç, metanol işleme membranları özler olduğunu göstermektedir, bu nedenle özel olarak zara bağlı olabilir proteinler için tavsiye edilmez. Bu şekilde P-CAMK-II sinyal o elde eğer metan göreli azalırol da kullanılabilir, ancak bu gelişen embriyonun bu aşamasında ve konum (böbrek) de, sinyal metanol tedavi olmadan tespit edilebilecek kadar güçlü olduğunu gösteriyor. O KV aşamasında doğru değildir;. Yani metanol P-CAMK-II immün görselleştirmek için gereklidir. Bu örnek sadece böbreğin Pronephric kanal gövde kas bitişik olan birleştirilmiş bir görüntü olarak gösterilir.

Özet olarak, burada açıklanan PFA / metanol sabitleme yöntemi GFP korunduğu ve F-aktin için boyama, asetile tubulin toplam CAMK-II ve P-CAMK-II ile uyumludur.

Şekil 1
Zebra balığı KV Asetillendirilmiş tubulin (silya) Şekil 1. P-CAMK-II karşıt. Tek bir canlı 12 hücre gruplarının aşamasının Görüntüler (12 ss) embriyo ar tarafından KV posterior konumunu ortaya koymaktadırrowhead (lateral görüntü, A) ve kutu içinde daire (ventral görünüm, B). Bu aşamada Embriyolar PFA / metanol kullanılarak tespit edildi. Embriyolar Alexa 488 -etiketli ikincil antikor (yeşil kanal) takip asetillenmiş tubulin boyama yapıldı. Daha sonra, P-CAMK-II'ye karşı tavşan poliklonal antikoru, bir Alexa 568- etiketli sekonder antikor (kırmızı kanal) takip etmiştir. Giderek daha yüksek büyütme (C, D) açıklandığı gibi iki kanallı floresan görüntü projeksiyonları elde edildi. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 12 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2,. P-CAMK II karşıtZebra balığı Böbrek boyunca Toplam CAMK-II. 30 hpf tek dechorionated embriyo PFA / metanol kullanılarak tespit edildi. Embriyolar daha sonra Alexa 488 etiketli sekonder antikor (yeşil) ve ardından toplam CAMK-II için boyandı. Daha sonra, P-CAMK II birincil antikor Alexa 568 etiketli sekonder antikor (kırmızı) ile takip edildi. Boyama, toplam CAMK-II ise Pronephric zebra balığı böbrek kanalları bitişik kas dokusu ve sarkomer boyunca hücre gruplarının sınırlarında zenginleştirilmiştir hattı hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca (kırmızı) aktif CAMK-II 'nin bir zenginleştirme ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu görüntüler, tüm böbrek görselleştirmek için metinde açıklanan daha düşük büyütmede elde edildi. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 13 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.


GFP için Şekil 3,., P-CAMK II Sayaç Imaged balığı Böbrek Hücreleri. Bu işlem 30 HPF embriyo cDNA'sı dominant negatif GFP-CAMK II. 13 Bu enjeksiyonlar, tipik bir mozaik ifadesi olduğunu gösterir kodlayan enjekte edildi. Embriyo PFA / metanol ile tespit ve daha sonra bir Alexa 568 etiketlenmiş sekonder antikor kullanılarak, P-CAMK-II için immüno-lekelendi. Görüntüleme GFP PFA / metanol fiksasyon, rehidrasyon, engelleme ve immün yoluyla devam ettiğini ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 13 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4, Zebra balığı İç Kulak Asetillendirilmiş tubulin ile>. P-CAMK-II karşıt. Bu 30 hpf embriyo PFA / metanol kullanılarak tespit edildi. Anti-asetillenmiş tübülin antikoru Alexa 488 -etiketli sekonder antikor, p-CAMK II antikoru ve Alexa 568 etiketli ikincil antikor tarafından sırada takip edildi. Boyama P-CAMK-II iç kulak kirpikler boyunca mevcut ve asetillenmiş tubulin ile birlikte lokalize olduğunu ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 14 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Zebra balığı İç Kulak Şekil 5. Aktin ve Asetillendirilmiş tubulin. Üç günlük (72 hpf) Zebra balığı embriyo sabit ve asetillenmiş t immunohistokimyasal edildiAlexa 568 -etiketli ikincil antikorlar kullanılarak ubulin, Alexa 488 Phalloidin kullanarak aktin görselleştirme izledi. Cilia yanı sıra kulak aksonal innervasyon (kırmızı) asetillenmiş tubulin ortaya çıkar ve F-aktin yapılar (yeşil) kas lifleri içerir. Zebra balığı kulak iki kirpikli duyusal bölgeleri daha detaylı olarak gösterilmiştir: anterior makulayı (am) ve posterior crista (pc). Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 14 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
. Zebra balığı Böbrek Membran GFP Şekil 6 P-CAMK-II Sayaç Imaged β-aktin olan bu tek bir birleştirilmiş görüntü: CAAX-GFP embriyo (30 hpf) sabit ve P-CaMK- için boyandı.II Alexa 568 etiketli ikincil antikor eklenmiştir. Boyama Pronephric zebrabalıkları böbrek kanalları hat hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca (kırmızı) devreye CAMK-II bir zenginleştirme ortaya koymaktadır. Bu böbrek duktal hücreleri sadece kas dokusu altına sokuldu ve her ikisi de (yeşil) membran hedeflenen GFP ifade tarafından işaretlenir. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PFA / metanol yöntemi zebrabalıkları gelişim sırasında fosfo-T 287 -CaMK-II epitopunun bağışık optimize temel amacı ile bu laboratuvarda geliştirilmiştir. Bu yöntem başarıyla zebrabalıkları KV, 14 ve özellikle KV aşamada böbrek. 13, bu tekniğin gerekli olduğu 12 iç kulak olmak üzere birçok siliyalı organların oluşumu sırasında P-CAMK-II lokalize. Bu yöntemin başarısı otofloresansı a) en aza indirilmesi, fosfo-CAMK II epitopunun b) korunması ve antikorlara epitop C) geliştirilmiş erişilebilirlik bir kombinasyonu muhtemeldir.

Bu yaklaşımın bir birincil sınırlamanın, metanol içinde depolama zamandır. P-CAMK-II immünoreaktivitesi, -20 ° C'de metanol içinde iki gün sonra maksimum olsa da, bu epitopun tepkime metanol içinde bir haftalık depolamadan sonra, kaybolur. Anda fosfat grubu hy olup olmadığı açık değildirdrolyzed ya da daha fazla denatürasyon bu immün reaktiviteyi azaltan oluşur. -20 ° C'de metanol / EGTA, erken embriyo gelişimi sırasında, tübülin zengin yapıların korunması için geleneksel olarak hızlı bir sabitleyici değildir. 22. Bununla birlikte, tek başına metanol'ün aktin hücre iskeletinin olarak morfolojisi ya da yapıların korunması için istenen bir durum değildir ve gelmelidir PFA.

Bu yaklaşımın diğer avantajları bu aynı zamanda F-aktin ve asetillenmiş tubulin diğer epitoplar koruyan ve GFP doğal floresans ortadan kaldırmaz vardır. Bu Dent sabitleyici olarak diğer sabitleyiciler, diğer epitoplarla 13 üstündür ve P-CAMK II boyama PFA / metanol daha Dent sabitleyici zayıf olsa da, P-CAMK II boyama ile uyumlu olmaya devam etmektedir. fosfo-proteinler erken gelişim sırasında aktif olan sinyal yolları yaygın olduğundan, Dent sabitleştirici ve PFA / metanol Zeb diğer fosfo-epitoplar için iki fiksatif olarak tavsiye edilirrafish embriyolar. Diğer proteinler ve bunların antikorları bu teknikle uygulamalar geliştirirken, bu immunoblötları da reaktif olan antikorları var ve klonlanmış ve antikorlar valide edilebildiği proteinleri aşırı olması yararlı olmuştur. 12

O a) protein düzeyinde gen bastırma doğrulamak ve b) eylem modellerinin geliştirilmesini sağlar çünkü bağışık tekniklerini optimize etmek için çabaya değer. Bu laboratuvarda, bu deneylerin sonuçları modellerle CAMK II fonksiyonları formülasyonunu izin vermiştir. Örneğin, KV konumu, bu organın rolü gibi, geçici ve asimetriktir. Böbrekte, Pronephric duktal hücrelerin apikal tarafında konumu kanalına gelen sinyallere yanıt rolleri önerir. Son olarak, kulak kinocilia tabanında belirli bir yoğun puncta bu enzim aktivasyonu yerelleştirilmiş Ca2 + sinyali göstermektedir. yöntemleri burada tarif edilenAyrıca iki floresan kanallarda herhangi bir embriyonik hücre tipinin yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için arayan herhangi bir araştırmacı için yararlı olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı hibe IOS-0817658 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Tags

Kimya Sayı 108 Fiksasyon fosfo-epitoplar kalsiyum kirpikler mikroskopi Kupffer en veziküllü böbrek kulak zebra balığı
Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothschild, S. C., Francescatto, L., … More

Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter