Summary
Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.
Abstract
A rápida proliferação das células, a expressão específica de tecido dos genes e o surgimento de redes de sinalização caracterizar o desenvolvimento embrionário no início de todos os vertebrados. A cinética e localização de sinais - mesmo dentro de uma única célula - no embrião em desenvolvimento complementa a identificação de genes de desenvolvimento importantes. técnicas de imunocoloração são descritas que têm sido mostrados para definir a cinética de sinais intracelulares e animais inteiros em estruturas tão pequenas quanto cílios. As técnicas para imagens de fixação, de imagem e de processamento usando um laser de varredura composto microscópio confocal pode ser concluído em apenas 36 horas.
Peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo desejável para os investigadores que buscam realizar estudos com uma espécie de vertebrados que é acessível e relevante para a doença humana. nocautes genéticos ou knockdowns deve ser confirmada pela perda do produto de proteína real. Essa confirmação da perda de proteínapode ser conseguido usando as técnicas descritas aqui. Pistas sobre as vias de sinalização também pode ser decifrada por utilização de anticorpos que são reactivos com as proteínas que foram modificadas pós-translacionalmente pela fosforilação. Preservar e otimizar o estado fosforilada de um epitopo é, portanto, fundamental para esta determinação e é realizado por este protocolo.
Este estudo descreve técnicas para fixar o primeiro embriões durante 72 h de desenvolvimento e de co-localizar uma variedade de epitopos relevantes com ciliares de vesículas de Kupffer (KV), o rim e o ouvido interno. Estas técnicas são simples, não exigem dissecção e pode ser completada num período relativamente curto de tempo. Projectar pilhas de imagens confocal em uma única imagem é um meio útil de apresentar estes dados.
Protocol
Os procedimentos de peixe-zebra neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Virginia Commonwealth University.
1. Preparação dos Reagentes
- 4% PFA / PBS. Pesar 8 g de paraformaldeído (PFA), na hotte. Enquanto ainda no exaustor de fumos, dissolve-se o PFA seco em ~ 80 mL de H2O destilada com agitação e aquecimento para 50 ° C. Enquanto se agita, adicionar 3 - 10 gotas de NaOH 1N fresco até que esteja completamente dissolvido PFA e solução fique límpida. Retire do fogo e adicione 100 ml 2x tampão fosfato salino (PBS). Levar o volume a 200 ml com H2O destilada Arrefecer até à TA e confirmar pH de 7,4 antes da utilização. Guardar no escuro a 4 ° C, mas usar dentro de uma semana.
- Usar 100% de metanol sem quaisquer suplementos. Use etanol a 95%, sem quaisquer suplementos.
- Prepare com fosfato Tween (PBT). Suplemento de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,1% de Tween-20. Adicionar 0.5 ml de uma solução de Tween-20 da 20% a 100 ml de 1x PBS. Armazenar à temperatura ambiente.
- Prepara-fosfato tamponada de Triton-X (PbTx). Suplemento de PBS com 0,1% de Triton X-100. Adicionar 0,5 ml de Triton um estoque 20% X-100 a 100 ml de PBS. Armazenar à temperatura ambiente.
- Preparar 10% NGS / PbTx. blocos normais de soro de cabra (NGS) Os locais de ligação não específicos. NGS armazenar em alíquotas a -20 ° C. Para usar, adicionar 1 ml de 9 ml PbTx.
- Preparar 50% de glicerol / PBS. Misturar completamente partes iguais de 2x PBS e 100% de glicerol. Armazenar à temperatura ambiente.
Fixação 2. Embrião
- . (. Por exemplo, β-actina: CAAX-GFP) Breeding Obter tipo selvagem (AB e WIK) ou transgênico embriões através de acasalamentos naturais. Se desejado, injectar embriões com construções ou morfolinos, como descrito 15,16.
- Elevar embriões. Recolhe embriões e incuba-se a 28,5 ° C, na presença de 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) para bloquear a pigmentação, como descrito. 17 p>
- Fix. Quando os embriões atingiram o estágio de desenvolvimento desejado, 18, anestesiar os embriões utilizando MESAB, remover tanta água quanto possível do sistema e adicionar fresco PFA a 4% / PBS durante 3-4 horas à temperatura ambiente. NOTA: Às vezes com menos de 20 horas após a fertilização (hpf), corrigir antes dechorionation. Às vezes após 20 hpf, dechorionate antes de fixação com dois pares de pinças de ponta fina sob um microscópio de dissecação.
- Mudando soluções. Transferência de embriões utilizando uma ampla pipeta furo, como descrito. 17 soluções para a mudança em 1,5 ml tapados microtubos, simplesmente permitindo embriões para resolver pela força da gravidade, sem centrifugação.
- Pós-fixador Após 3 -. 4 horas, remova PFA / PBS, substitua com 100% de metanol e armazenar a -20 ° C durante pelo menos 48 horas. NOTA: Para máxima imunorreactividade de P-CaMK-II, limitar o tempo de armazenamento total de metanol a uma semana.
- Coloque um mínimo de 10 embriões para cada condição experimental em tubo de microcentrífuga de 1,5 ml tampado, e rotulá-los.
- Permitir que os embriões para resolver. Remover e descartar o metanol e re-hidratados com lavagens progressivas contendo 0,5 ml de concentrações decrescentes de etanol, tal como indicado no passo seguinte. Cada etapa é uma lavagem de 5 minutos com balanço.
- Progressivamente hidratar com estes 5 Soluções: 66% de etanol / 33% PbTx, 33% de etanol / 66% PbTx, 100% PbTx, 100% PbTx (esta é a primeira repetição de PbTx), 100% PbTx (esta é a segunda repetição PbTx).
- Remover última lavagem PbTx. Adicionar 0,5 ml de 10% NGS / PbTx. Incuba-se durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente com agitação suave e em seguida, remover e descartar solução.
- Preparar a solução de anticorpo primário por diluição em 10% NGS / PbTx. Se co-imunocoloração, utilize o anticorpo maior afinidade em primeiro lugar. Para este estudo, incubar com o anticorpo monoclonal de ratinho anti tubulina-acetilado diluído a 1: 500. para example, se existem 10 amostras, combinam 6 ul de solução de anticorpo com 3 ml de estoque de 10% NGS / PbTx e, em seguida, distribuem 0,3 mL desta a cada tubo.
- Adicionar 0,2 - 0,5 ml do anticorpo primário diluído a cada tubo de mergulhar todos os embriões. Incube com agitação suave O / N à temperatura ambiente.
- Na parte da manhã, remova e elimine a solução de anticorpo. Adicionar 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para lavar anticorpo primário em excesso. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes.
- Dim luzes do tecto e dilui-se o anticorpo secundário fluorescente apropriado conjugado em 10% NGS / PbTx de modo que cada condição contém, pelo menos, 0,5 ml. Com o anticorpo primário tubulina de ratinho anti-acetilado, utilizar a IgG anti-ratinho de cabra corante fluorescente verde a uma diluição de 1: 500.
- Incubar anticorpo secundário durante 4 h, com agitação suave à TA no escuro. A partir de agora, o processo as amostras sob luzes se apagaram e incubar em um recipiente escuro ou por envolvimento em folha de alumínio.
- No final da incubação, remover e descartar a solução de anticorpo secundário. Adicionar 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para lavar. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes.
- Se for co-imunocoloração, obter o segundo anticorpo primário a partir de uma espécie diferente do que o primeiro anticorpo primário. Nestes estudos, a seguir o anticorpo de coelho anti-fosfo-CaMK II pelo anticorpo secundário IgG conjugado com corante de cabra anti-coelho-vermelho fluorescente.
- Dilui-se anticorpo de coelho anti-fosfo-II CaMK anticorpo 01:20. Para cada tubo de embriões, suspensão em 0,3 ml de 10% NGS / PbTx, em seguida, adicionar 15 ul de solução de anticorpo estoque.
- Certifique-se de que os embriões são imersos e luzes se apagarem. Incube com agitação suave O / N à temperatura ambiente no escuro.
- Na parte da manhã sob as luzes ofuscantes, remova e elimine a solução de anticorpo. Adicionar 0,5 ml de 2% NGS / PbTx. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes.
- Mantenha luzes do teto dim e diluir o suficiente da fluorescência-conju apropriadaanticorpo secundário fechado de modo a que cada condição contém, pelo menos, 0,5 ml. Neste estudo, diluir o corante de cabra conjugado com anticorpo anti-coelho-vermelho fluorescente IgG secundário (canal vermelho) 1: 500 em 10% NGS / PbTx.
- Incubar segundo anticorpo secundário durante 4 horas com agitação suave à TA no escuro.
- No final desta incubação e sob luz fraca, remover e descartar a solução de anticorpo secundário. Adicionar 0,5 ml de PbTx. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes. Armazenar em qualquer PbTx ou 50% de glicerol / PBS, dependendo do procedimento de imagiologia.
4. confocal Imaging and Processing
- Mount embriões para a imagem latente. Coloque 1 - 5 embriões em uma lâmina de vidro. Criar uma câmara entre a lamela principal e o slide usando fragmentos lamela em cada lado da câmara. Normalmente, quatro # 1 lamelas são usados para fazer estas pilhas espaçadores sem vedação.
NOTA: No meio de montagem é necessária. - Use uma imersão em óleo de 100Xobjetivo trazer único embrião em foco usando luz transmitida. Apague a luz. Ligue microscópio confocal. Assegurar que os lasers apropriados (verde e / ou vermelho) estão ligados e accessary foco remoto está envolvida.
- Ligue o programa confocal. No "bar Acquire", selecione o próprio objecto. No bar "XY Basic", definir o tamanho da imagem para 1024, clicando no botão 1.024.
- No "Laser e Detector" bar, clique na caixa de 488 vermelho e 568 a caixa verde para ligar a laser e detector para cada canal. Definir pinhole para médio e ajustar o ganho no bar "Gain" de cada canal de visualizar.
- No bar "Configurações de Obtenção de", clique em "Live" para começar a aquisição de imagens. No bar "Ver Definições", desmarque a caixa "Forçar Integral Zoom" para o centro na janela "Live".
- No bar "Adquirir Configurações", na guia "Z", percorrer as camadas da imagem. Depois de seleccionar o Number de secções ópticas de incorporar a imagem, mover-se para algum ponto no "centro" do plano z.
- Sob a guia "Z", clique na pequena caixa vermelha "Referência". Isto irá zerar a RFA no ponto escolhido como o "centro". Na caixa "Tamanho do Passo", selecione a espessura das camadas (entre 0,25 mm e 2,0 mm é ideal). Preste atenção para a caixa "Tamanho" e tentar limitar a 1GB.
NOTA: Normalmente, até 40 secções ópticas de 0,5-1,0 uM são obtidos, mas o número de secções podem ser determinadas empiricamente. - Para encontrar o extremo superior da imagem, clique no círculo ao lado de "Top" e mover-se através das camadas z. Agora clique no círculo ao lado de "Bottom", o computador terá a imagem de volta para a camada como o centro. Mais uma vez se mover através das camadas para encontrar o extremo inferior da imagem.
- Clique em "Live" novamente em "Configurações de Obtenção de" caixa para parar o laseraquisição. Neste painel, clique nas caixas vermelhas marcadas média e Z-stack. Estas caixas ficará verde.
- Na caixa "Configurações de Obtenção de", clique em "Single" para adquirir toda a série de imagens. Você pode monitorar o progresso como ele verifica em ambos os canais e através de todo o z-stack.
- Para salvar, clique na janela de volume e clique em "salvar como" e nomeie o arquivo. Salvar como um arquivo ".IDS". Ao volume de processar o arquivo enquanto o z-stack ainda está em aberto, selecione os dados no menu suspenso e clique em "volume de render". Salve o arquivo processado como um arquivo TIFF. Esta é a imagem projectada que são mostrados nesta publicação.
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Representative Results
Condições ideais para a visualização de fosfo-epítopos
Métodos que descrevem a imunolocalização de epitopos da proteína em embriões de peixe-zebra foram relativamente escassas em comparação com aqueles para a localização de ARNm através de hibridação in situ. Os fixadores usados na localização de epítopos de proteínas em células ciliadas de embriões de peixe-zebra incluíram 4% PFA / PBS e fixador de Dent, que é uma mistura de metanol e DMSO. 19 Localização de ARN por toda a montagem de hibridização in situ (pedido) é tipicamente conseguida utilizando PFA seguido por armazenamento em metanol a 100%. 20,21 os nossos estudos revelaram que a combinação DESEJOS fixador, ao limitar o tempo em metanol para entre dois e sete dias, era muito superior a qualquer outro fixador para a imunolocalização com o anticorpo P-CaMK-II . O sinal obtido com esta combinação PFA / metanol foi ALSO significativamente maior do que quando o fixador de Dent, 4% PFA / PBS ou metanol foram utilizados isoladamente, dependendo do tempo de desenvolvimento e localização dentro do embrião.
Ao optimizar a técnica descrita aqui e para cada tempo de desenvolvimento e fixador utilizado, uma amostra de controlo foi preparada em que todos os passos foram seguidas, excepto que o anticorpo primário foi omitido. Tais amostras de controlo não tinham um sinal de fluorescência quando visualizada sob as mesmas condições descritas acima. Este controle é recomendado para outros pesquisadores a replicar essa abordagem com qualquer anticorpo.
A combinação / metanol fixador PFA deu o sinal mais forte P-CaMK-II e foi também compatível com marcação para tubulina acetilada, que é um marcador padrão para os cílios. Developmentally, o primeiro órgão ciliadas que emerge e tem sido trabalhada nesses estudos é vesícula do Kupffer (KV). O KV está localizado na extremidade posterior da notocorda, como mostrado na fase de 12 somito (15 HPF) (Figura 1). A KV é um órgão transitório e é responsável pela assimetria esquerda-direita. Ela emerge no 2-somite estágio (12 hpf) e desaparece ao redor do palco de 18 somite. Batendo cílios gerar de um escoamento circular do líquido, o que leva a uma elevação de Ca2 + nas células ciliadas que revestem o KV e a activação de CaMK-II em locais discretos (Figura 1). P-CaMK-II reactividade aparece e desaparece, de um lado do KV enquanto cílios são bater 12. Nesta fase inicial, os níveis totais de embrionárias CaMK-II ainda são apenas metade do nível como no 24 HPF e um décimo do nível aos 3 dias de desenvolvimento. 11 Talvez porque a expressão total de CaMK-II é relativamente baixo em 15 hpf, qualquer melhoria na técnica de imunomarcação, nesta fase, é especialmente importante.
betwept 24 e 72 HPF de desenvolvimento, P-CaMK-II aparece na superfície apical das células ciliadas revestem regiões específicas das condutas pronephric (Figuras 2,3). A imunorreactividade do total CaMK-II ao longo de toda a conduta pronephric e ao longo de somitos adjacentes (Figura 2) demonstram que apenas um subconjunto de CaMK embrionário-II é activada (P-CaMK-II).
Fixação condições sejam compatíveis com a preservação GFP fluorescência
Estas técnicas de fixação também são compatíveis com a manutenção de fluorescência verde proteína fluorescente (GFP), sem reforço (Figura 3). No GFP-tagged CaMK-II construção que é usado nesta figura, GFP mantém fluorescência suficiente embora PFA / fixação metanol e imunocoloração subsequente. Numa vista de alta ampliação de células que revestem o ducto pronephric (Figura 3), The expressão de GFP-mosaico CaMK-II pode ser visto em células que também foram imunocoradas para a P-CaMK-II.
O ouvido embrionário do peixe-zebra é um outro tecido no qual a elevação do Ca 2+, agindo através CaMK-II, influencia o seu desenvolvimento. 14 orelhas Zebrafish normalmente aparecem em cerca de um dia de desenvolvimento. Neste momento, CaMK-II é activada intensamente na base dos kinocilia e a níveis inferiores ao longo do cinocílio (Figura 4). Este conjunto de imagens que mostra esta técnica de fixação e imunolocalização pode detectar coloração dentro cílios, uma estrutura cuja secção transversal é menor do que 1 um. Esses cílios manter a sua estrutura ao longo deste processo de fixação e imunocoloração.
Um exemplo adicional de contracoloração de duas cores no ouvido interno em um momento posterior de desenvolvimento foi conseguida por coloração com ambos Alexa 488faloidina e anti-tubulina acetilada seguido por um Alexa 568 etiquetado o anticorpo secundário (Figura 5). Vale ressaltar que o método / metanol fixação PFA preserva tanto F-actina e tubulina, o que não é verdade de todos os fixadores. Este exemplo é mostrado como uma imagem de cor resultante da fusão para toda a orelha e, em seguida, para as sub-regiões. 14
Um exemplo representativo final de contraste de duas cores foi conseguida com uma estirpe de peixe que produziu embriões com GFP-alvo de membrana (Figura 6). Membranas alvo GFP não está ligado a qualquer outra proteína e perde-se quando extraída com metanol, pelo que esta imagem foi obtida a partir de peixe que foram fixadas com PFA sozinhos. Este resultado sugere que o tratamento com metanol extrai membranas, por isso não é recomendada para proteínas que podem ser exclusivamente ligado à membrana. O sinal P-CaMK-II nesta figura é diminuída em relação ao conseguido se metanol, também foram utilizados, mas isto demonstra que, nesta fase, e o local (rim) do embrião em desenvolvimento, o sinal é suficientemente forte para ser detectada sem tratamento metanol. Isso não é verdade na fase KV;. Ou seja, o metanol é necessário para a visualização P-CaMK-II imunocoloração. Este exemplo é mostrado como uma imagem de fusão onde conduta pronephric do rim é adjacente aos músculos do tronco.
Em resumo, o método de fixação / metanol PFA aqui descrito é compatível com a preservação da GFP e com coloração de F-actina, tubulina acetilada, o total de CaMK-II e P-CaMK-II.
Figura 1. P-CaMK-II contrastadas para Acetilados Tubulin (cílios) em KV Zebrafish. Vistas de um único estágio 12 somite ao vivo (12 ss) embrião revela a localização posterior da KV pelo arrowhead (vista lateral, A) e o círculo dentro da caixa (vista ventral, B). Embriões nesta fase foram fixados com PFA / metanol. Os embriões foram histoquímica para tubulina acetilada seguido por um 488 anticorpo secundário marcado com Alexa (canal verde). Em seguida, o anticorpo policlonal de coelho contra a P-CaMK-II foi seguido por um anticorpo secundário marcado 568- Alexa (canal vermelho). Projeções de imagens fluorescentes de dois canais foram adquiridas conforme descrito em ampliações progressivamente maiores (C, D). Barra de escala = 10 mm. Este valor é modificado a partir de uma publicação anterior. 12 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. P-CaMK-II para contrastadasTotal de CaMK-II ao longo do rim Zebrafish. Um embrião dechorionated única em 30 hpf foi fixado através de PFA / metanol. Os embriões foram então coradas para o total CaMK-II seguido pelo anticorpo secundário marcado Alexa 488 (verde). Em seguida, o anticorpo primário P-CaMK-II foi seguido pelo anticorpo secundário marcado Alexa 568 (vermelho). Coloração revela um enriquecimento de activado CaMK-II (a vermelho) ao longo da superfície apical das células que revestem os ductos do rim do peixe-zebra pronephric que a soma CaMK-II é enriquecido nos limites somito de tecido muscular adjacente e ao longo sarcómeros. Barra de escala = 50 mm. As imagens foram obtidas com uma ampliação menor do que é descrito no texto, a fim de visualizar todo o rim. Este valor é modificado a partir de uma publicação anterior. 13 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. P-CaMK-II Contador Imaged para GFP em células de rim de peixe zebra. Este embrião HPF 30 foi injectado com um ADNc que codifica uma dominantes negativos GFP-CaMK-II. 13 Essas injecções mostrar tipicamente a expressão do mosaico. O embrião foi fixada usando PFA / metanol e, em seguida, imunocoradas para a P-CaMK-II, utilizando um anticorpo secundário marcado Alexa 568. Imagiologia revela que GFP persiste através PFA fixação / metanol, reidratação, bloqueio e imunocoloração. Barra de escala = 10 mm. Este valor é modificado a partir de uma publicação anterior. 13 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 P-CaMK-II contrastadas com Acetilados Tubulin em Ear Zebrafish Interior. Este embrião 30 hpf foi fixado através de PFA / metanol. O anticorpo anti-tubulina acetilada foi seguido em ordem pelo anticorpo secundário marcado com Alexa 488, o anticorpo P-CaMK-II e o anticorpo secundário marcado com Alexa 568. Coloração revela que P-CaMK-II está presente ao longo dos cílios ouvido interno e co-localiza com tubulina acetilada. Barra de escala = 5 uM. Este valor é modificado a partir de uma publicação anterior. 14 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Actina e acetilado Tubulin em Ear Zebrafish Interior. A três dias de idade (72 hpf) embrião de peixe-zebra foi fixado e histoquímica para acetilada tubulin usando Alexa 568 marcado com anticorpos secundários, seguido de visualização de actina utilizando Alexa 488 faloidina. Cilia, bem como inervação axonal da orelha é revelado por tubulina acetilada (em vermelho) e estruturas de F-actina incluem fibras musculares (em verde). Duas regiões sensoriais ciliadas do ouvido do peixe-zebra são mostrados em mais detalhe: a mácula anterior (AM) e crista posterior (PC). Barra de escala = 10 mm. Este valor é modificado a partir de uma publicação anterior. 14 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 6 P-CaMK-II Contador Imaged de membrana GFP no rim Zebrafish Esta imagem única resultante da fusão em que a β-actina:. CAAX-GFP embrião (30 hpf) foi fixada e corada para P-CaMK-II seguido pelo anticorpo secundário marcado Alexa 568. Coloração revela um enriquecimento de activado CaMK-II (em vermelho) ao longo da superfície apical das células que revestem os ductos do rim zebrafish pronephric. Estas células do ducto renal são aninhado logo abaixo do tecido muscular e ambos são marcadas pela expressão de GFP membrana alvo (em verde). Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método / metanol PFA foi desenvolvido neste laboratório com o objetivo principal de otimizar a imunolocalização do fosfo-T 287 -CaMK-II epitopo durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Este método localizada com êxito P-CaMK-II durante a formação de vários órgãos, incluindo o ciliadas KV peixe-zebra, 12 ouvido interno 14 e do rim. 13 em particular na fase KV, esta técnica foi necessário. O sucesso deste método é provavelmente devido a uma combinação de a) minimização da autofluorescência, b) a preservação do epitopo fosfo-CaMK-II e c) melhorar a sua acessibilidade do epitopo para anticorpos.
Uma limitação principal desta abordagem é o tempo de armazenamento em metanol. Enquanto imunorreactividade de P-CaMK-II é máxima ao fim de dois dias em metanol a -20 ° C, a reactividade deste epítopo é perdido após uma semana de armazenamento em metanol. Não é claro se nesta altura o grupo fosfato é HYdrolyzed ou mais desnaturação ocorre que diminui a imunorreactividade. Metanol / EGTA a -20 ° C é tradicionalmente um fixador rápido para preservar as estruturas de tubulina rica em durante o desenvolvimento de embriões precoces. 22 No entanto, o metanol por si só não é desejável para a preservação da morfologia estruturas ou mesmo como o citoesqueleto de actina e deve ser precedido por PFA.
Outras vantagens desta abordagem são que ela também conserva outros epitopos, tais como F-actina e tubulina acetilada e não elimina a fluorescência nativa de GFP. Outros fixadores, como fixador de Dent, são superiores a outros epítopos 13 e permanecer compatível com coloração P-CaMK-II, embora P-CaMK-II coloração é mais fraca em fixador de Dent de PFA / metanol. Desde fosfo-proteínas são predominantes nas vias de sinalização que estão ativas durante o desenvolvimento precoce, fixador de Dent e PFA / metanol são recomendados como dois fixadores para outros fosfo-epitopos em Zebembriões rafish. No desenvolvimento de aplicações com esta técnica para outras proteínas e os seus anticorpos, tem sido útil ter anticorpos que também são reactivos em imunoblots e ter clonado e proteínas com as quais os anticorpos podem ser validados sobre-expresso. 12
Vale a pena o esforço para otimizar técnicas de imunolocalização porque a) pode verificar a supressão do gene ao nível da proteína e b) permite o desenvolvimento de modelos de ação. Neste laboratório, os resultados destes ensaios têm permitido a formulação de modelos que funciona por meio de CaMK-II. Por exemplo, a sua localização no KV é transiente e assimétrica, como o papel deste órgão. No rim, a sua localização no lado apical das células ductais pronephric sugere funções que respondem a sinais a partir da conduta. Finalmente, a activação desta enzima nos pontos lacrimais intensa específica na base da orelha kinocilia sugere um sinal localizada Ca2 +. Os métodos aqui descritostambém deve ser útil para qualquer investigador que procura obter imagens de alta resolução de qualquer tipo de célula embrionária em dois canais fluorescentes.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão do National Science Foundation IOS-0817658.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
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