Summary
此协议的目的是演示从冠脉循环鼠主要血管平滑肌细胞的分离和培养技术（血管平滑肌细胞）。一旦血管平滑肌细胞已被分离，它们可用于许多标准培养技术。
Abstract
虽然分离及大血管的血管平滑肌细胞（VSMC）的文化是公认的，我们试图从冠脉循环分离培养血管平滑肌细胞。用完整主动脉弓心中取出并经由逆行的Langendorff用含有300单位/ ml胶原酶II型，0.1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂和1M 的 CaCl 2消化溶液灌注。所述灌流液分别以15分钟的间隔为90分钟，通过离心沉淀收集，再悬浮于电镀媒体，并接种在组织培养皿。通过SM22α的存在下，α-SMA，波形蛋白和血管平滑肌细胞进行表征。之一的使用这种技术的主要优点是，从小鼠的冠脉循环隔离血管平滑肌细胞的能力。虽然获得可以限制一些可用于其中细胞的应用程序单元的数量少，分离的冠状血管平滑肌细胞可以在多种成熟的细胞培养技术和阿萨用于YS。研究调查转基因小鼠的血管平滑肌细胞可以提供有关的结构功能和血管病变相关的信号传导过程的详细信息。
Introduction
该方法的目标是分离来自鼠冠状循环的血管平滑肌细胞（VSMC），用于在细胞培养物和标准细胞培养测定中使用。我们开发这种技术来评估在糖尿病血管重塑的分子机制。之前我们已经内向肥厚性重塑报道在1型糖尿病的的db / db小鼠模型中间隔冠状小动脉。由于在小鼠中隔冠状动脉发现组织的有限数量，标准的实验技术调查的db / db小鼠和对照小鼠的蛋白质变化（ 如免疫印迹）难以在最好的。此外，我们以前曾表明，血管紧张素受体 阻断剂（ARB）氯沙坦降低db / db小鼠2中观察到的重塑。因此，从冠脉循环主血管平滑肌细胞的隔离允许我们进一步调查在血管平滑肌细胞的表型或活化信号转导途径在糖尿病小鼠的变化，这可能是contribu婷不良冠脉动脉重塑。
许多研究已阐明了利用啮齿类动物主动脉，血管平滑肌细胞中分离规范的信号转导通路，而不是在每一个具体的血管床。然而，我们已经证明血管床在冠状动脉，主动脉具体重塑，和db / db小鼠1的肠系膜环流，这表明在各血管床的血管平滑肌细胞可以是不同的。因此，有必要分离来自每个血管床血管平滑肌，以便更好地理解在每一组的VSMCs发生的病理变化。有不同的方法进行分离和培养平滑肌细胞主动脉过多。然而，目前，仅存在一个已发布对来自小鼠冠脉循环3平滑肌细胞的分离研究。腾等 。是第一个报道的方法分离从鼠标冠脉循环血管平滑肌细胞;但是，我们有显著修订了协议，他们还分离内皮CELLS。其他实验室还使用从腾等的协议。分离冠状动脉细胞和气道平滑肌细胞4,5。我们已掺入的变动将产生高度富集用于从所述冠脉循环血管平滑肌细胞的细胞群。
在分离的哺乳动物心脏或者Langendorff灌注技术的逆行灌注，由奥斯卡的Langendorff成立于1897年6，目前仍在广泛使用的今天心血管细胞的分离。这里介绍的技术，加上现代的小鼠遗传修饰的进步，提供了从冠脉循环血管平滑肌细胞的分子行为的调查，接近一个有价值的工具。
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Protocol
伦理学声明：这项研究是根据健康指南全国学院进行，它是在全国儿童医院批准机构的动物护理和使用委员会。
1.准备/设置
注意：此隔离技术需要定位侧由端上的环待机2的Langendorff加热线圈，和并联连接到一个循环水浴中。
- 开启循环水浴和调节温度的的Langendorff插管的尖端达到33-34℃的最终温度（在此所用的水浴设定为40℃，由于一个6-7℃的损失在整个管道温度）。打开灌注泵和设置灌注率0.5毫升/分钟。
- 冲洗各用50毫升70％乙醇后，再用100毫升高压灭菌超纯水清洗两者水夹套的加热线圈的，附着油管和25号插管。
- 清除加热线圈通过推动空气用注射器，用10ml Hank氏平衡盐溶液（HBSS）洗无酚红。在加热线圈和管道离开的HBSS。
- 附加填充有室温下的HBSS无酚红到管道10ml无菌鲁尔锁注射器。确保附接HBSS灌封注射器时，因为这可以在消化过程中导致空气栓子到血管平滑肌细胞分离产生不利影响没有气泡被截留在管和加热线圈的内部。
- 在另一10ml无菌注射器填充有冰冷的HBSS无酚红移除的加热线圈和地点25号插管。保持这个冰上待用。重复其他套管。
- 准备酶消化解决方案。
- 根据特定的批号权衡型胶原酶2 75毫升消化溶液达到300单位/毫升的最终浓度。
- 在75ml的HBSS用酚红溶解胶原酶。接下来，添加加入1.5ml 0.1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂和75微升的1M氯化钙2到混合物中。
- 如果立即用消化解决方案，它加热至37℃。如果不是，将其放置在4℃下长达6小时。该解决方案必须由每日新鲜。
- 准备一站式解决方案/平板培养基。
- 加入100 ml热灭活的FBS，加入5ml L-谷氨酰胺，5毫升的非必需氨基酸，将5ml的HEPES，和1ml primocin的至500ml高葡萄糖（4.5克/升）的DMEM。建议除菌过滤。
- 等分试样6毫升在4℃终止液成每十的15毫升锥形管，编号为A1-A6和B1-B6，和地点。等分试样50毫升的停止溶液到50毫升锥形并发生在37℃培养箱中。
注意：此步骤也可在必要时当天制备隔离之前。此终止溶液将用作以下细胞分离电镀介质。
- 准备两个1毫升注射器配备了为30G针头用100微升肝素（1000单位/ ml）。
- 切5厘米长5-0手术丝绸。只要两次扳平一松上手结在外科丝一端为其他。放置到25号插管，但不要拧紧。重复其他地下25插管。
- 用2ml无菌，冰冷，HBSS不含酚红的装满四35毫米无菌培养皿中（＃1-4）。置于冰上。
2.安乐死，心脏分离和插管
- 心脏隔离之前，确保终止液消解液和50毫升的锥形是温暖的。删除与来自滴定管夹（或环形支架钳）冰和地点上环支架连接地下25插管HBSS充式注射器。
- 麻醉，用3％异氟烷的小鼠。确认小鼠是通过在每个后肢趾触摸麻醉。如果腿部抽搐，鼠标还没有麻醉所以等待1分钟，重复触脚尖。
- 通过去除皮草露出颈静脉第二皮肤上用剪刀颈部的前部。接下来，使用镊子小心地移除颈静脉任何脂肪。去除脂肪后，缓缓注入肝素100微升（1000单位/ ml）。放置海绵手术在静脉，避免流血过多。
- 1分钟后，开胸暴露心脏，心脏电梯用弯钳和用剪刀切除它，确保保持升主动脉完好无损通过第一头臂分支。立即将心脏到35毫米的菜用冰冷的HBSS（＃1）无酚红和冲洗。
注意：请用解剖范围以下4个步骤。 - 位置被安装在环上的地下25插管站在一个45°角，使尖端刚好位于冰冷的HBSS的表面下在培养皿＃2和显然通过解剖显微镜可见。的心脏转移到菜＃2。
- 使用杜蒙钳，由经钝性分离至P轻轻去除多余的脂肪暴露主动脉r事件刺入或主动脉撕裂。接下来，使用镊子在地下25插管主动脉滑动。
- 通过主动脉，接近，但不超过主动脉瓣，这将损害阀的完整性并因此，逆行灌注向下引导插管。一旦插管就位，在主动脉滑动预先打结丝，并拧紧。领带的第二结以形成围绕主动脉平结，以确保心脏。
- 一旦主动脉被牢固地捆绑，轻轻地从在附着在地下25插管注射器与冰冷的HBSS冠脉循环冲洗剩余的血液。小心不要推太多，以避免过多的压力冠心病。只有非常缓慢轻柔冲洗才能完成冲洗。这个温柔的冲洗过程中也可以观察到无泄漏的主动脉插管。
- 打开灌注泵开始HBSS的流动。取出地下25插管（附带的心脏）从HBSS充式注射器，同时注意保持充满HBSS套管座，并将其连接到温暖的HBSS填充加热线圈。以0.5毫升/分钟为8分钟的速度开始与灌注泵的心脏灌注。
- 第一个心脏插管和系统上正在灌注后，重复步骤2.1-2.8的第二心脏。这些隔离会错开每一个心脏，因此需要仔细的规划和时间安排。
3.消化
- 用HBSS冲洗后，在泵目前改变至10毫升HBSS注射器一个填充用10ml预热的消化溶液。以0.5毫升/分钟的速率灌注用12分钟的消化溶液每个心脏。不收集分数从这个第一所产生的消化，因为这将包含任何残血细胞和内皮细胞。
- 12分钟后，改变它的灌注率0.4毫升/分钟，将装有冷停止SOLUT 15毫升的锥形（管A1或B1，对应于第一或第二心脏对于每个消化）离子进入，以便开始VSMC富集灌流收集冰桶的心脏下方。
- 15分钟后，这两种级分的采集后立即在89 XG改变集合锥形到管A2或B2和自旋锥形管A1和B1 10分钟。当填充有泵上的消化溶液的注射器具有小于1毫升溶液，替换的消化溶液新鲜充10毫升注射器。
- 离心后，从每个采集管吸出上清液，留下大约为0.5毫升从A1重悬沉淀用2ml的暖终止溶液（或电镀介质）。从A1管加入悬浮到B1管与管的地方在37℃孵化器与帽松动。
- 重复步骤3.3和3.4，直到所有的管（至A6和B6）被用于90分钟的总采集时间。在80分钟的消化，切开心脏顶点冲洗掉可能被困心室内的任何单元格，并收集这些细胞在试管A6和B6，respe沉着应对。
注意：有时心脏就会脱落之前的90分钟时间点套管。如果发生这种情况，检索心脏和地方进入无菌35毫米培养皿填充用2ml消化溶液。切开心脏的顶点，并轻轻漂洗消化解决方案的心脏。接着，通过无菌100微米的细胞滤网过滤的2ml消化溶液到50毫升锥形，并加入到管A6或B6。 - 随后管（A2和B2）的每个自旋后，加入再悬浮的血管平滑肌细胞到先前收集管（组合A1和B1）。另外，注意不要让泵消解液用完了，整个切换消化必要的10毫升注射器。
- 所有管进行组合后，离心富VSMC-悬浮液在89×g离心10分钟。
- 从收集管尽可能吸出尽可能多的上清液。悬浮颗粒残留在2毫升电镀媒体和板在一次35 100mm培养碟。地方培养皿我N 37℃培养箱中24小时。
4.细胞培养
注：完成生物安全柜中的剩余步骤。
- 24小时后，轻轻地吸出镀介质。培养通常会有大量的碎片。洗涤细胞，加入2毫升温，无菌PBS和而在顺时针运动旋转轻轻拍打菜针对两个手指。
- 旋转360°后，吸出PBS，重复第二次。吸出PBS，并添加另外2毫升无菌，温暖的PBS。检查在显微镜下的培养皿，以确保有一点要上盘无杂物。细胞融合，也可以在此时确定的。
- 如果碎片留在培养皿中，重复步骤4.2。如果培养皿是明确的碎片，吸出PBS并加入2毫升温镀媒体。
- 24小时后，用温，无菌PBS再次洗涤细胞以除去从培养的任何最终碎片或死细胞。吸出PBS和p花边对细胞另外2毫升温镀媒体。
- 每天检查细胞和饲料每48小时用新鲜的温热镀介质。在这点上，细胞可以用于标准细胞培养测定。血管平滑肌细胞应该是大约80％汇合4-5天电镀后，直到该过程被完善尽管可能需要长达7天。如果拆分到后续段落，最多使用1：435毫米菜（或到培养皿相当的区域）。
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Representative Results
由于我们的冠状动脉平滑肌细胞分离技术的新颖方面，我们试图确定该细胞分离的纯度。根据它们的形态和免疫荧光染色到通道2.基于细胞培养的第一次洗涤后的形态学小鼠冠状动脉平滑肌进行了鉴定，分离过程中有效地除去心肌细胞和内皮细胞。的血管平滑肌细胞保留其形态高达通道2（ 图1）。然而，有污染的由外膜和间质成纤维细胞的可能性。为了排除这种潜在变乱，我们染色分离的细胞为SM22α，α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），两者的VSMC标记物7,8，和波形蛋白，成纤维细胞标记9，在通道1-2（ 图2）。我们观察到没有这些标记通过通道2.我们还表明的变化，我们的细胞分离是缺乏CD31的/ PECAM染色（人类科伦用作阳性对照进制微血管内皮细胞），这表明缺乏使用这个隔离协议内皮细胞污染。总的来说，我们的细胞分离方法得到从冠脉循环血管平滑肌细胞的几乎纯的人口，现在可以用于进一步的实验。
图1：代表培养冠状动脉血管平滑肌细胞培养血管平滑肌细胞的冠状动脉（第2代）从明场相衬条件下放大10倍成像杂db / db小鼠中分离。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：Immunofl培养冠状动脉血管平滑肌细胞的荧光染色。从杂镀冠状动脉血管平滑肌细胞（的db / db）小鼠标记为SM22α，α-SMA，波形蛋白抗体通道1-2，和CD31 / PECAM。在放大10倍拍摄的图像。用通道没有观察到显著变化。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这项研究的目的是适应现有的细胞分离协议，以增加冠状血管的产量从小鼠心脏流畅。大部分血管平滑肌生物学的开拓性工作与培养的大鼠主动脉平滑肌细胞进行。这些研究提供了控制血管平滑肌细胞生长，迁移和肥厚7分子机制的基础知识。然而，如该领域的进展，它变得明显VSMC表型和功能是由许多血管床的具体因素来控制。例如，相比于周围血管，冠状动脉显示不同的功能反应，损伤表现出响应生长不同的模式和显示通道，受体和信号分子10,11的一个独特的阵列。冠状床也暴露于独特的血流动力学的力，由于容器是由订约心肌在心收缩期间被压缩。我们最近的研究表明，科伦2型糖尿病db / db小鼠元微血管重塑主动脉和肠系膜阻力血管1,12不同。要了解使用低传血管平滑肌细胞是必要的，这些差异，体外研究的分子机制。虽然有多种用于分离和培养的鼠主动脉或肠系膜动脉平滑肌细胞不同和行之有效的方法，目前，仅存在一个已发布对VSMCs从小鼠冠脉循环3的隔离研究。
在这个协议中，我们证明了来自冠脉循环原代鼠血管平滑肌细胞的分离的改进的方法。我们的协议是松散基于一个由腾等人出版。3。我们已应用到原始技术的修改提供富集群体和血管平滑肌细胞的产率较高。要取得这些成果的关键步骤包括套管的正确位置，轻柔冲洗心脏的ING，去除多余血液，和切割心脏的顶点在消化结束。三者中，套管的位置是极其重要的。冠脉循环是从冠状动脉口正好远离主动脉瓣灌注。因此经由套管插入阀完整性到左心室腔室的破坏会导致不良冠状动脉灌注，并在可行的血管平滑肌细胞的数量急剧减少。冠脉循环的平缓冲洗不仅会从用于培养的最终的沉淀除去过量的血液，但也将决定套管的正确位置是否实现。最后，在消化过程中，某些血管平滑肌细胞可沉积在心室的内侧，从而切割该顶点在消化会释放细胞中并在电镀得到更大的汇合的结论。
可使用的一个重要的改进是使用地下25灌胃针或一个哈佛仪器小鼠主动脉cannul的一个代替针套管。但是，使用灌胃针时，必须格外小心，不要堵塞与球的冠状动脉口在针的末端。如果针的调整灌注之前需要温柔冲洗一步就会发现。此外，在消化溶液中使用胶原酶的类型是最佳的VSMC隔离重要。 II型胶原酶是不是纯粹的 - 它包含其它的酶，如胰蛋白酶，梭菌和酪。因此，大豆胰蛋白酶抑制剂的量加入到消化溶液可能需要基于特定大量消化利用胶原酶进行调整。
该技术的一个限制是，来自整个冠脉循环血管平滑肌细胞是分离的。我们以前主要集中在冠状动脉微血管研究（80-120微米直径）1,2，然而，在小鼠主要冠状动脉较大（> 160微米）13。此外，这种技术NIQUE也从冠状静脉循环，而不仅仅是动脉循环分离细胞。
而的Langendorff技术已经被用来超过100年，最近的小鼠基因组操纵进步（ 例如敲入，敲除，突变）提供利用我们更新技术的多种应用一个独特的机会。分离和培养后，将细胞可用于另外的实验，包括病毒感染和治疗药剂。转基因小鼠和标准细胞培养的共同使用将允许从鼠冠脉循环血管平滑肌细胞的更深的调查。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（R01HL056046 PAL并K99HL116769到AJT）的研究所在全国儿童医院（PAL并AJT）的支持，。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
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