Une plate-forme microfluidique pour l'isolement à haut débit unique cellule et Culture
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
À l'heure actuelle plaçant des cellules isolées individuellement dans un espace de culture est généralement réalisée en utilisant une dilution limitante ou une cellule activé par fluorescence (FACS). Pour de nombreux laboratoires, ce qui limite la dilution est une méthode commode, car il nécessite seulement une pipette et des plaques de culture de tissus, qui sont facilement disponibles. Dans ce cas, la suspension cellulaire est diluée en série jusqu'à une densité cellulaire appropriée, et ensuite placée dans des puits de culture à l'aide d'une pipette manuelle. Ces cellules isolées compartimentés sont ensuite utilisés pour l' analyse de cellules, telles que l' hétérogénéité génétique de dépistage 1 et 2 , la formation de colonies. Cependant, cette méthode est faible débit et la main-d'œuvre, sans avoir recours à un bras de robot d'assistance, car la nature de la distribution de Poisson de la méthode de dilution limitante limite d' événements monocellulaires à une probabilité maximale de 37% 3. machines FACS avec un bras robotisé intégré peuvent surmonter la limitation de la distribution de Poisson par précision placment une seule cellule dans une culture bien à un moment 4. Cependant, la contrainte de cisaillement mécanique élevée (ainsi, réduit la viabilité cellulaire) 5 et à l' achat des machines et les coûts opérationnels ont limité son utilisation dans de nombreux laboratoires.
Pour surmonter les limitations ci – dessus, les dispositifs micrométriques ont été développés pour charger très efficacement des cellules individuelles dans des micropuits 6. Cependant, les micropuits ne fournissent pas suffisamment d'espace pour les cellules chargées de proliférer, en raison de la nécessité de rendre la taille de chaque micro-puits proche de celle d'une cellule unique pour maximiser la probabilité de chargement unicellulaire. Que des analyses de culture sont nécessaires dans de nombreuses applications basées sur des cellules (par exemple, le dosage clonogénique 7), les grands micropuits (90-650 um de diamètre ou une longueur latérale) ont également été utilisées pour permettre les cultures cellulaires étendus. Cependant, comme la méthode de dilution limite, ils possèdent également de faibles rendements cellule de chargement unique, allant de 10 -. 30% 89
Auparavant, nous avons développé une plate – forme microfluidique à haut débit pour isoler des cellules uniques dans des micropuits individuels et démontrer son application dans le dosage clonogénique des cellules isolées. 10 Le dispositif a été fait avec poly-diméthylsiloxane (PDMS), et comprend deux ensembles de réseaux de micropuits avec différentes tailles de micropuits, qui peut largement améliorer l'efficacité dans le chargement d'une seule cellule dans un micropuits dont la taille est beaucoup plus importante que la cellule. En particulier, ce concept de «double puits» permet à la taille de la zone de culture pour être ajustée de manière flexible sans affecter l'efficacité de capture de cellule unique, ce qui rend facile d'ajuster la conception du dispositif en fonction de différents types de cellules et d'applications. Cette méthode à haut rendement devrait être utile pour des expériences de culture cellulaire à long terme pour les études d'hétérogénéité cellulaire et monoclonal établissement de la lignée cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Systèmes de dispositifs à base de micropuits-6,14 ont été utilisés pour la manipulation de cellules isolées et de l' analyse, comme à grande échelle cellule unique piégeage 6 et souches hématopoïétiques seule la prolifération des cellules 15. Bien que la taille bien, le nombre et la forme peut être ajustée pour des applications spécifiques, l'efficacité de l' isolement à cellule unique est toujours compromise lorsque la taille du puits est augmentée. 9…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
