Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
Actualmente la colocación de las células individuales de forma individual en un espacio de cultivo se logra comúnmente mediante el uso de la dilución limitante o células activadas por fluorescencia (FACS). Para muchos laboratorios, dilución limitante es un método conveniente, ya que sólo requiere una pipeta y del tejido placas de cultivo, que son fácilmente disponibles. En este caso, una suspensión de células se diluye en serie a una densidad celular apropiada, y después se colocó en pocillos de cultivo mediante el uso de una pipeta manual. Estas células individuales compartimentados se utilizan entonces para el análisis de células, tales como la heterogeneidad genética de detección 1 y 2 Formación de Colonias. Sin embargo, este método es de bajo rendimiento y de trabajo intensivo, sin utilizar un brazo robótico para la asistencia, ya que la naturaleza distribución de Poisson del método de dilución limitante restringe eventos de una sola célula a una probabilidad máxima de 37% 3. máquinas de FACS con un brazo robótico integrado que pueden superar la limitación de la distribución de Poisson con precisión por placing una sola célula en un pocillo de cultivo a la vez 4. Sin embargo, el alto esfuerzo de cizalla mecánica (por lo tanto, disminuye la viabilidad celular) 5 y la compra de la máquina y los costes operativos han limitado su uso en muchos laboratorios.
Para superar las limitaciones anteriores, los dispositivos a microescala se han desarrollado para altamente eficiente cargar células individuales en micropocillos 6. Sin embargo, los micropocillos no proporcionan un espacio adecuado para las células cargadas proliferen, debido a la necesidad de hacer que el tamaño de cada pocillo, próxima a la de una sola célula para maximizar la probabilidad de carga de una sola célula. Como se requieren ensayos de cultivo en muchas aplicaciones basadas en células (por ejemplo, ensayo clonogénico 7), micropocillos de mayor tamaño (90 a 650 micras de diámetro o de longitud lateral) también se han utilizado para permitir cultivos celulares prolongados. Sin embargo, como el método de dilución limitante, también poseen bajas eficiencias individuales de carga de células, que van desde 10 -. 30% 8, 9
Anteriormente, hemos desarrollado una plataforma de microfluidos de alto rendimiento para aislar células individuales en micropocillos individuales y demostrar su aplicación en ensayo clonogénico de las células aisladas. 10 El dispositivo se hizo con poli-dimetilsiloxano (PDMS), y comprende dos conjuntos de matrices de micropocillos con diferentes tamaños de micropocillos, que pueden mejorar en gran medida la eficiencia en la carga de una sola célula en un micropocillo cuyo tamaño es significativamente más grande que la célula. Cabe destacar que este concepto de "doble bien" permite que el tamaño de la zona de cultivo para ajustarse de manera flexible sin afectar a la eficiencia de la captura de una sola célula, por lo que es fácil de ajustar el diseño del dispositivo para adaptarse a diferentes tipos de células y aplicaciones. Este método de alta eficiencia debería ser útil para experimentos de cultivo celular a largo plazo para los estudios de heterogeneidad celular y el establecimiento línea celular monoclonal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistemas de dispositivos basados en micropocillos 6,14 se han utilizado para la manipulación de una sola célula y análisis, como única célula a gran escala atrapando 6 y la proliferación de células madre hematopoyéticas única 15. Aunque el tamaño así, el número y forma se puede ajustar para aplicaciones específicas, la eficacia de aislamiento de una sola célula se ve comprometida siempre cuando se aumenta el tamaño del pozo. 9,15
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
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