פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
כרגע הצבת תאים בודדים בנפרד בחלל תרבות מושגת בדרך כלל באמצעות דילול מגביל או תא מופעל קרינת מיון (FACS). למעבדות רבות, הגבלת דילול היא שיטה נוחה, כמו זה רק דורש צלחות תרבות פיפטה ורקמות, אשר זמינות. במקרה זה, השעית תא הוא מדולל סדרתי צפיפות תאים מתאימה, ולאחר מכן להציב לתוך בארות תרבות באמצעות פיפטה ידנית. תאים בודדים המחולקים אלה משמשים לניתוח תא, כגון מגוון גנטי הקרנת היווצרות 1 ו מושבת 2. עם זאת, שיטה זו היא נמוכה תפוקה ועבודה אינטנסיבית, ללא ניצול זרוע רובוטית עבור סיוע, כי טבעו התפלגות פואסון של שיטת הדילול המגבילה מגביל אירועים-תא בודד כדי הסתברות מקסימלית של 37% 3. מכונית FACS עם זרוע רובוטית משולבת יכול להתגבר על המגבלה של התפלגות פואסון ידי במדויק Placing מתא בודד אחד בתרבות היטב בכל פעם 4. עם זאת, לחץ הגזירה המכאני הגבוה (ובכך, הוריד כדאיויות תא) 5 ורכישת מכונית ועלויות תפעול מוגבלות השימוש שלה במעבדות רבות.
כדי להתגבר על המגבלות לעיל, התקנים microscale פותחו כדי מאוד ביעילות לטעון תאים בודדים לתוך microwells 6. עם זאת, microwells אינו מספק מרחב מספיק עבור התאים הטעונים להתרבות, בשל הצורך של עשייה את הגודל של כל microwell קרוב לזה של תא בודד כדי להגביר את סיכוי טעינת תא הבודד. כמו מבחני תרבות נדרשים ביישומים רבים מבוסס תאים (למשל, clonogenic assay 7), microwells הגדול (מ 90 – 650 מיקרומטר בקוטר או באורך צד) גם כבר נוצל כדי לאפשר בתרביות תאים מורחבות. עם זאת, כמו שיטת הדילול המגבילה, הם גם בעלי יעילות טעינת תא בודדת נמוכה, הנעים בין 10 -. 30% 8, 9
בעבר, פיתחנו פלטפורמה microfluidic תפוקה גבוהה לבודד תאים בודדים microwells הפרט להפגין היישום שלה assay clonogenic של תאים בודדים. 10 המכשיר נעשתה עם פולי-dimethylsiloxane (PDMS), ונחלק לשני סטים של מערכים microwell עם גדלי microwell שונים, אשר יכול לשפר את היעילות בעיקר בטעינת תא בודד בתוך microwell שגודל הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר התא. יש לציין, זה "כפול גם" המושג מאפשר גודל השטח תרבות להיות מותאם באופן גמיש מבלי להשפיע על יעילות לכידת תא בודד, מה שהופך אותו פשוט כדי להתאים את העיצוב של המכשיר כדי להתאים סוגים ויישומים סלולריים שונים. שיטת יעילות גבוהה זה צריכה להיות שימושי עבור ניסויים בתרביות תאים לטווח ארוכים ללימודי ההטרוגניות תא הקמת קו סלולארי חד שבטית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכות מכשירות מבוסס microwell 6,14 כבר נוצלו עבור מניפולצית תא בודד וניתוח, כגון תא בודד בקנה מידה גדולה השמן 6 ובחלוקה של תאי גזע hematopoietic יחיד 15. למרות גודל היטב, מספר, וצורה יכולה להיות מותאם עבור יישומים ספציפיים, את יעילות בידוד התא היחיד נפגעה תמיד כאש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
