新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列
Summary
これらの研究では、我々は、回生の研究で使用するための新規、新生児マウスの心臓足場のための方法論を提供します。
Abstract
The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.
Introduction
心不全は一般的で致命的です。これは、臓器への血流を阻害し、身体満たされていないの代謝要求を残す心臓の収縮低下をもたらす進行性疾患です。 570万人のアメリカ人が心不全を有し、それは米国9における入院の主要な原因であると推定されます。米国における心不全の患者を治療するための集団的コストは年間9-10につき$ 300億ドルを超えました。末期の心不全のための唯一の決定的な治療法は、同所心臓移植です。毎年、10万人以上のドナーの心臓は、米国1-2で心臓移植の手続きのために必要とされていると推定されています。ドナーの限られた数に、わずか約2400移植は、米国2で毎年行われています。明らかに、この臓器不足は、他の戦略がtransplantaための付加的な臓器を産生するために必要とされるように対処する必要があります拒絶反応や生涯免疫抑制に関連する合併症を回避するようションとは、理想的には、これらの器官は、自己のだろう。
哺乳類の成体の心筋細胞は、損傷時に限られた再生能力を実証するが、最近の証拠は、哺乳動物の新生児の心がけが5-8以下の驚くべき再生能力を維持することを示唆しています。具体的には、部分的な外科的切除後、再生ウィンドウが誕生し、生後7日目、この回生期間は線維性瘢痕の欠如によって特徴づけられる、血管新生の形成、心外膜からの血管新生因子の放出、および心筋細胞の増殖5-8との間で発見されました、11。この時間の回生ウィンドウには、バイオ人工心臓の開発のための材料の新規供給源としての新生児の心臓を使用しての可能性を提供します。
細胞外マトリックスはcardiomyocytを促進する重要な手がかりを提供することが知られていますEの増殖と成長。新生児と成人の行列12および再生を促進する能力において分子の利用可能性の明確な違いは、13を検討されています。脱細胞化された成人のマトリックスは、細胞の再増殖およびバイオ人工心臓の発生のためのECMの足場を提供するために、いくつかの研究で使用されてきました。これらの研究、および幹細胞技術の新たな発見は、急速に進展しているが、いくつかのハードルが満たされていません。例えば、マトリックスの天然構造、マトリックス壁への細胞の統合、およびすべての制限このアプローチの成功増殖と成長をサポートする能力を維持するには限界。優れた再生属性は新生児心臓に帰されてきたが、そのような組織を使用して実用的な側面は、その探索を制限しています。
新生児の心臓の実証された再生能力に基づいて、我々は、開発することによって、新たな行列を開発しましたP3のマウスの心臓のための脱細胞化の手法。以前は6に決定するが、心臓が収穫、脱細胞化および再細胞化に十分な大きさであるとして、それは心臓再生のウィンドウ内にあるようP3の心はこれらの研究のために選択しました。本研究の目的は、新生児マウスの心臓から行列を作成することの実現可能性を実証することです。我々の研究は、ECMの構造とタンパク質性の整合性を維持しながら、分、新生児の心臓を脱細胞化の実現可能性のための証拠を提供します。また、mCherryを発現する心筋細胞でこの心臓ECMを再細胞化する能力を示す、我々は再細胞化後の種々の心臓マーカーの発現のために、これらの心筋細胞を検討しました。この技術は、バイオ人工心臓の開発のための新生児の行列の優位性のテストのためにできるようになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
心の繰り返し灌流にこの技術の依存性は、塞栓症の回避成功した結果の重要な要素になります。ステップ2.2から2.6での心臓の初期カテーテル法からは、ステップ2.8から2.14の間の溶液の変化に、心筋に灌流液の流れを損なう気泡の導入を可能にすることができる操作があります。新生児心臓の小柄なサイズに、血管系であっても微小な気泡は、このように不完全な脱細胞化をレンダリング、技…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.
Materials
| 1. Materials For Mouse Heart Isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials For Decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22g x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| 22 x 1 g needle | BD | 305155 | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1X Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials For DNA Quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl*6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue. | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating. | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
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