Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

Summary

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

A insuficiência cardíaca é comum e mortal. É uma doença progressiva que resulta na diminuição da contractilidade do coração, o que prejudica o fluxo sanguíneo para os órgãos e deixa as necessidades metabólicas do corpo não satisfeitas. Estima-se que 5,7 milhões de americanos têm insuficiência cardíaca e é a principal causa de hospitalização nos Estados Unidos ^9. O custo coletivo de tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca nos Estados Unidos ultrapassa os US $ 300 bilhões de dólares por ano ^9-10. O único tratamento definitivo para a insuficiência cardíaca em fase terminal é o transplante cardíaco ortotópico. Cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações transplantados são necessários para os procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos ^1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas cerca de 2.400 transplantes são realizados a cada ano em os EUA ^2. Claramente, esta escassez de órgãos precisa ser tratada como outras estratégias são necessários para produzir órgãos adicionais para transplantação e, idealmente, estes órgãos seriam autóloga, de modo a evitar as complicações associadas com a rejeição e imunossupressão vida.

Cardiomiócitos adultos mamíferos demonstrar uma capacidade de regeneração limitada após lesão, mas evidências recentes sugerem que os corações neonatais mamíferos manter uma notável capacidade de regeneração após lesão ^5-8. Especificamente, após a ressecção cirúrgica parcial, uma janela de regeneração foi descoberto entre o dia do nascimento e pós-natal 7. Este período de regeneração é caracterizada por uma falta de cicatriz fibrótica, formação de neo vascularização, libertação de factores angiogénicos a partir do epicárdio, e proliferação de cardiomiócitos ^{8/5 , 11.} Esta janela de tempo regenerativa fornece o potencial para a utilização do coração neonatal como uma nova fonte de material para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

A matriz extracelular é conhecida por fornecer pistas importantes para promover cardiomyocyte a proliferação e crescimento. Diferenças distintas na disponibilidade de moléculas nas matrizes neonatais e adultos ^{de 12} e sua capacidade para promover a regeneração foram exploradas ^13. matrizes adultos descelularizados têm sido utilizados em vários estudos para fornecer um andaime ECM para repovoamento celular e a geração de um coração bioartificial. Embora esses estudos, e novas descobertas em tecnologias de células-tronco, estão avançando rapidamente, vários obstáculos ainda precisam ser cumpridos. Por exemplo, as limitações em preservando a estrutura nativa da matriz, a integração celular na parede da matriz, e capacidade para suportar a proliferação e crescimento de todos os limites do sucesso desta abordagem. Enquanto atributos regenerativos superiores têm sido atribuídas ao coração neonatal, os aspectos práticos da utilização de um tecido tal têm limitado a sua exploração.

Com base na capacidade regenerativa demonstrada do coração neonatal, desenvolvemos novas matrizes através do desenvolvimento de umtécnica de descelularização para o coração do rato P3. O coração P3 foi escolhido para estes estudos, uma vez que está dentro da janela de regeneração cardíaca como anteriormente determinada ⁶ mas o coração é suficientemente grande para colheita, decellularize e recellularize. O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da criação de uma matriz de um coração neonatal mouse. Os nossos estudos fornecem evidência para a viabilidade de um minuto descelularizante, coração neonatal, mantendo a integridade estrutural e proteinácea do ECM. Nós também demonstrar a capacidade de recellularize este ECM cardíaca com mCherry cardiomiócitos expressam e examinamos esses cardiomiócitos para a expressão de vários marcadores cardíacos seguintes recelularização. Esta tecnologia permitirá que para o ensaio da superioridade de uma matriz neonatal para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

Protocol

Todas as experiências de rato foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act dos EUA e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Minnesota. 1. Método para coração mouse Isolamento Euthanize um rato neonatal por decapitação com uma única lâmina de uso. Pincelar o tórax com 70% de etanol. Dissecar a pele do peito, cortando-o afastado da parede torácica com uma tesoura padrão enquanto puxa a pele lateralmente com um par de # …

Representative Results

decelularização Em média, o tempo para a descelularização de um coração P3 utilizando este protocolo é de aproximadamente 14 horas. dado um peso médio do coração de 23 mg para o recém-nascido P3. acelularidade Figura 3a mostra um coração neonatal P3 totalmente intacto (conjunto de montagem). Figura 3b mostra o mesmo coração seguinte descelulariza?…

Discussion

A dependência desta técnica em perfusões repetidas do coração faz a prevenção de uma embolia um componente crítico de um bom resultado. A partir do cateterismo do coração inicial nos Passos 2,2-2,6, para as mudanças de solução entre as etapas 2.8-2.14, existem manipulações que podem permitir a introdução de bolhas de ar que comprometem o fluxo de perfusato no miocárdio. Devido ao tamanho diminuto do coração neonatal, mesmo minúsculas bolhas na vasculatura pode causar um enfarte técnica, tornando as…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.