Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

Summary

En estos estudios, se entrega metodología para la novela, andamios cardiacos neonatales, murinos para su uso en estudios de regeneración.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

La insuficiencia cardíaca es común y mortal. Es una enfermedad progresiva que da como resultado la contractilidad disminuida del corazón, lo que impide el flujo de sangre a los órganos y las hojas de las demandas metabólicas de la insatisfecha cuerpo. Se estima que 5,7 millones de estadounidenses tienen insuficiencia cardiaca y es la primera causa de hospitalización en los Estados Unidos ^9. El costo colectiva de tratamiento de los pacientes en la insuficiencia cardíaca en los Estados Unidos excede $ 300 mil millones de dólares por año ^9-10. El único tratamiento definitivo para la insuficiencia cardíaca en fase terminal es el trasplante ortotópico de corazón. Cada año, se estima que se necesitan más de 100.000 corazones de donantes para procedimientos de trasplante cardíaco en los Estados Unidos ^1-2. Debido al limitado número de donantes, sólo aproximadamente 2.400 trasplantes se realizan cada año en los EE.UU. ^2. Claramente, esta escasez de órganos debe ser abordado ya que se requieren otras estrategias para producir órganos adicionales para Transplantala e, idealmente, estos órganos sería autólogo a fin de evitar las complicaciones asociadas con el rechazo y la inmunosupresión de por vida.

Cardiomiocitos adultos de mamíferos demuestran una capacidad regenerativa limitada después de la lesión, pero la evidencia reciente sugiere que los corazones neonatales de mamíferos mantienen una notable capacidad de regeneración después de la lesión ^5-8. En concreto, después de la resección quirúrgica parcial, una ventana regenerativa ha descubierto entre el nacimiento y postnatal día 7. Este período de regeneración se caracteriza por una falta de cicatriz fibrótica, formación de neovascularización, liberación de factores angiogénicos del epicardio, y la proliferación de los cardiomiocitos ^{5-8 , 11.} Esta ventana de regeneración de tiempo proporciona la posibilidad de utilizar el corazón neonatal como una nueva fuente de material para el desarrollo de un corazón bioartificial.

La matriz extracelular es conocido proporcionar señales importantes para promover cardiomyocytproliferación e y el crecimiento. Claras diferencias en la disponibilidad de las moléculas en las matrices neonatales y adultos ¹² y su capacidad para promover la regeneración se han explorado ^13. matrices adultos descelularizado se han utilizado en varios estudios para proporcionar un andamio ECM para la repoblación celular y la generación de un corazón bioartificial. Si bien estos estudios, y los nuevos descubrimientos en tecnologías de células madre, están avanzando rápidamente, varios obstáculos aún no se han cumplido. Por ejemplo, las limitaciones en la preservación de la estructura nativa de la matriz, la integración celular en la pared de la matriz, y la capacidad para apoyar la proliferación y el crecimiento de todos limitan el éxito de este enfoque. Mientras que los atributos regenerativos superiores se han atribuido al corazón neonatal, los aspectos prácticos del uso de un pañuelo de papel tales han limitado su exploración.

Sobre la base de la capacidad de regeneración demostrado del corazón neonatal, hemos desarrollado nuevas matrices mediante el desarrollo de unatécnica de descelularización para el corazón P3 ratón. El corazón P3 fue elegido para estos estudios, ya que se encuentra dentro de la ventana de la regeneración cardiaca como se determina previamente ⁶ pero el corazón es lo suficientemente grande para la cosecha, decellularize y recellularize. El objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de crear una matriz de un corazón neonatal de ratón. Nuestros estudios proporcionan evidencia de la viabilidad de decellularizing un minuto, corazón neonatal mientras se mantiene la integridad estructural y proteico de la ECM. También demostramos la capacidad de recellularize este ECM cardiaca con mCherry cardiomiocitos expresan y hemos examinado estos cardiomiocitos para la expresión de diversos marcadores cardíacos siguientes recelularización. Esta tecnología permitirá para la prueba de la superioridad de una matriz neonatal para el desarrollo de un corazón bioartificial.

Protocol

Todos los experimentos con ratones se realizaron de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Minnesota. 1. Método para el ratón El aislamiento del corazón La eutanasia a un ratón neonatal por decapitación con una sola pala uso. Hisopo el tórax con 70% de etanol. Diseccionar la piel del pecho por el corte lejos de la pared del pecho con unas tijeras estándar, mientras que tiran…

Representative Results

descelularización En promedio, el tiempo para la descelularización de un corazón P3 usando este protocolo es de aproximadamente 14 hr. dado el peso del corazón promedio de 23 mg para el recién nacido P3. Acellularity La figura 3a muestra un corazón neonatal P3 completamente intacto (todo el montaje). La Figura 3b muestra el mismo corazón después de descel…

Discussion

La dependencia de esta técnica en repetidas perfusiones del corazón hace que la evitación de una embolia un componente crítico de un resultado exitoso. Desde el cateterismo inicial del corazón en los pasos 2,2-2,6, a los cambios de solución entre pasos 2.8-2.14, existen manipulaciones que pueden permitir la introducción de burbujas de aire que comprometen el flujo de líquido de perfusión en el miocardio. Debido al tamaño diminuto del corazón neonatal, incluso burbujas hora en la vasculatura pueden causar un i…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.