Новорожденных сердца Каркасы: Новые Матрицы для регенеративных исследований

Summary

В этих исследованиях, мы предлагаем методологию новых, неонатальных, мышиные сердца подмостей для использования в регенеративных исследований.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

Сердечная недостаточность является общим и смертельно опасны. Это прогрессирующее заболевание, которое приводит к снижению сократительной способности сердца, что ухудшает приток крови к органам и оставляет метаболические потребности неудовлетворенных тела. По оценкам, 5,7 миллиона американцев страдают сердечной недостаточностью , и это является основной причиной госпитализации в Соединенных Штатах ^9. Коллективный стоимость лечения пациентов при сердечной недостаточности в Соединенных Штатах превышает 300 миллиардов долларов в год ^9-10. Только радикальная терапия для конечной стадии сердечной недостаточности ортотопическая пересадка сердца. Каждый год, по оценкам, более 100000 сердца доноров необходимы для сердечных процедур трансплантации в США ^1-2. Из – за ограниченного числа доноров, лишь около 2400 трансплантаций ежегодно проводится в США ^2. Очевидно, что этот дефицит орган необходимо решать, как другие стратегии необходимы для создания дополнительных органов для transplantaции и, в идеале, эти органы были бы аутологичной таким образом, чтобы избежать осложнений, связанных с отторжением и времени жизни иммуносупрессии.

Млекопитающие взрослые кардиомиоциты демонстрируют ограниченную регенеративную способность после травмы , но последние данные свидетельствуют о том , что у млекопитающих неонатальные сердца поддерживать замечательную регенеративную способность после повреждения ^5-8. В частности, после частичной хирургической резекции, регенеративный окно было обнаружено между рождением и постнатальный день 7. Этот восстановительный период характеризуется отсутствием фиброзного рубца, формирование неоваскуляризации, высвобождение ангиогенных факторов из эпикарда и кардиомиоцитов пролиферации ^{5-8 , 11.} Это регенеративная окно времени обеспечивает потенциал для использования сердца новорожденной как новый источник материала для развития биоискусственных сердца.

Внеклеточный матрикс, как известно, обеспечивают важные сигналы для содействия cardiomyocytе пролиферации и роста. Четкие различия в доступности молекул в неонатальных и взрослых матриц ¹² и их способности содействовать регенерации, были исследованы ^13. Decellularized взрослых матрицы были использованы в ряде исследований, чтобы обеспечить ECM эшафот для сотовых репопуляции и генерацию биоискусственных сердца. В то время как эти исследования, и новые открытия в области стволовых клеточных технологий, быстро развиваются, несколько препятствий, которые еще должны быть выполнены. Например, ограничения в сохранении нативной структуры матрицы, клеточной интеграции в матрицу стены, а также способность поддерживать пролиферацию и рост всех предела успех этого подхода. В то время как превосходные регенеративные атрибуты были приписаны сердца новорожденной, практические аспекты использования такой ткани ограничили его исследование.

На основе продемонстрированной регенеративной способности сердца новорожденной, мы разработали новые матрицы посредством разработкиТехника decellularization для сердца P3 мыши. Сердце Р3 была выбрана для этих исследований , как он находится в пределах окна регенерации сердца , как ранее определено ⁶ , а сердце является достаточно большим , чтобы урожай, decellularize и recellularize. Целью данного исследования является демонстрация возможности создания матрицы из сердца новорожденной мыши. Наши исследования дают доказательства осуществимости decellularizing минуту, неонатальный сердце при сохранении структурной и белковую целостность ECM. Мы также продемонстрировать способность recellularize этот сердечный ECM с mCherry, выражающих кардиомиоцитов и мы исследовали эти кардиомиоциты для экспрессии различных кардиомаркеров следующих recellularization. Эта технология позволит для тестирования превосходства новорожденных матрицы для развития биоискусственных сердца.

Protocol

Все эксперименты мыши были выполнены в соответствии с Законом США охране животных и были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Университете штата Миннесота. 1. Метод для мышей сердца изоляции Эвтаназии неонатальную мышь обезглавливани…

Representative Results

Decellularization В среднем, время decellularization из Р3 сердца, используя этот протокол составляет около 14 ч. учитывая средний вес сердца 23 мг для P3 новорожденному. Acellularity 3 , а демонстрирует полностью неповрежденным P3 сердц?…

Discussion

Зависимость этой методики при повторных перфузии сердца делает предотвращение эмболии одним из важнейших компонентов успешного результата. Из начального катетеризацию сердца на этапах 2,2-2,6, к изменениям раствора между стадиями 2.8-2.14, есть манипуляции, которые могут позволить введени…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.