Neonatal Cardiac Stilladser: Nye Matricer til regenerativ Studies

Summary

I disse undersøgelser giver vi metodologi for nye, neonatale, murine hjerte-stilladser til brug i regenerative studier.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

Hjertesvigt er almindelig og dødbringende. Det er en fremadskridende sygdom, som resulterer i nedsat kontraktilitet af hjertet, som hæmmer blodtilførslen til organer og efterlader de metaboliske krav af kroppen udækket. Det anslås, at 5,7 millioner amerikanere har hjertesvigt, og det er den primære årsag til indlæggelse i USA ^9. Den kollektive udgifter til behandling af patienter i hjertesvigt i USA overstiger $ 300 milliarder dollars om året ^9-10. Den eneste definitive terapi for slutstadiet hjertesvigt er ortotopisk hjertetransplantation. Hvert år skønnes det, at der er behov for mere end 100.000 donorhjerter for hjertetransplantation procedurer i USA ^1-2. På grund af de begrænsede antal donorer, er det kun ca. 2.400 transplantationer udføres hvert år i USA ^2. Det er klart, skal løses som andre strategier er forpligtet til at producere yderligere organer til transplanta dette organ mangeltion og helst ville disse organer være autologe for at undgå komplikationerne forbundet med afvisning og levetid immunosuppression.

Pattedyr voksne cardiomyocytter demonstrerer en begrænset regenerativ kapacitet på skade, men nye oplysninger tyder på, at pattedyr neonatale hjerter opretholde en bemærkelsesværdig regenerationsevne efter skade ^5-8. Specifikt efter delvis kirurgisk resektion, en regenerativ vindue er blevet opdaget mellem fødsel og postnatal dag 7. Denne regenerative periode er kendetegnet ved en mangel på fibrotisk ar, dannelse af neovaskularisering, frigivelse af angiogene faktorer fra epicardiet og cardiomyocyte proliferation ^{5-8 , 11.} Denne regenerative tidsvindue tilvejebringer mulighederne for at anvende den neonatale hjertet som en ny kilde til materiale til udvikling af en biosyntetiske hjerte.

Den ekstracellulære matrix er kendt at tilvejebringe vigtige signaler til fremme cardiomyocyte spredning og vækst. Tydelige forskelle i tilgængeligheden af molekyler i de neonatale og voksne matricer ¹² og deres evne til at fremme regenerering er blevet udforsket ^13. Decellulariseret voksne matrixer har været anvendt i flere undersøgelser for at tilvejebringe en ECM stillads for cellulær repopulation og genereringen af ​​et biosyntetiske hjerte. Mens disse undersøgelser, og nye opdagelser i stamceller teknologier, der udvikler sig hurtigt, flere forhindringer er endnu ikke opfyldt. For eksempel begrænsninger i bevarelsen native struktur af matrixen, cellulære integration i matricen væg, og evne understøtte proliferation og vækst al grænse succesen af ​​denne tilgang. Mens overlegne regenerative egenskaber er blevet tilskrevet den neonatale hjerte, har de praktiske aspekter af at anvende et sådant væv begrænset sin udforskning.

Baseret på den demonstreret regenerationsevne det neonatale hjerte, har vi udviklet hidtil ukendte matricer ved at udvikle enTeknikken med decellularization for P3 mus hjerte. P3 hjerte blev valgt til disse undersøgelser, da det er inden for vinduet af hjertets regenerering som tidligere bestemte ⁶ men hjertet er stor nok til høst, decellularize og recellularize. Målet med denne undersøgelse er at demonstrere muligheden for at skabe en matrix fra en neonatal mus hjerte. Vores undersøgelser giver bevis for muligheden for decellularizing et minut, neonatal hjerte samtidig med at den strukturelle og proteinholdige integritet ECM. Vi viser også evnen til at recellularize denne cardiac ECM med mCherry udtrykker cardiomyocytter, og vi har undersøgt disse cardiomyocytter for ekspression af forskellige hjerte-markører efter recellularization. Denne teknologi vil muliggøre afprøvning af overlegenhed en neonatal matrix for udviklingen af ​​en biosyntetiske hjerte.

Protocol

Alle mus blev udført i henhold til US dyreværnsloven og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Minnesota. 1. Metode til Mouse Heart Isolation Aflive en neonatal mus ved halshugning med en enkelt anvendelse klinge. Svaber brystkassen med 70% ethanol. Skær skindet fra brystet ved at skære det væk fra brystvæggen med standard saks, mens du trækker huden lateralt med et par # 5 pincet. Perforere maven lige ringere end brystbenet med…

Representative Results

Decellularization I gennemsnit tid til decellularization af et P3 hjerte ved hjælp af denne protokol er cirka 14 timer. givet en gennemsnitlig hjertevægt af 23 mg til P3 nyfødte. Acellularity Figur 3a viser et fuldt intakt P3 neonatal hjerte (hel mount). Figur 3b viser den samme hjerte efter decellularization. Figurerne 4a og 4b viser hematoxy…

Discussion

Afhængigheden af ​​denne teknik på gentagne perfusioner af hjertet gør undgåelse af en blodprop et afgørende element i et vellykket resultat. Fra den indledende kateterisation af hjertet i trin 2,2-2,6, at ændringerne i løsning mellem trin 2.8-2.14, er der manipulationer, der kan tillade indføring af luftbobler som kompromis strømmen af ​​perfusatet i myokardiet. På grund af det ringe omfang af det neonatale hjerte, kan selv små bobler i vaskulaturen forårsage en teknisk infarkt, således gøre decel…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.