नवजात कार्डिएक Scaffolds: पुनर्योजी अध्ययन के लिए उपन्यास Matrices

Summary

इन अध्ययनों में, हम उपन्यास, नवजात, murine हृदय पुनर्योजी अध्ययन में इस्तेमाल के लिए scaffolds के लिए कार्यप्रणाली प्रदान करते हैं।

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

दिल की विफलता आम और घातक है। यह एक प्रगतिशील बीमारी है जो दिल है, जो अंगों को रक्त प्रवाह को बाधित और शरीर unmet की चयापचय की मांग के पत्तों की कमी आई है सिकुड़ना में यह परिणाम है। यह अनुमान है कि 5.7 करोड़ अमेरिकियों को दिल की विफलता है और यह संयुक्त राज्य अमेरिका में ⁹ अस्पताल में भर्ती का प्राथमिक कारण है। संयुक्त राज्य अमेरिका में दिल की विफलता में रोगियों के उपचार के सामूहिक लागत प्रति वर्ष ^9-10 $ 300 अरब डॉलर से अधिक है। अंत में मंच दिल की विफलता के लिए ही निश्चित चिकित्सा ओर्थोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण है। हर साल, यह अनुमान है कि 100,000 से अधिक दाता दिलों में संयुक्त राज्य अमेरिका के ^1-2 हृदय प्रत्यारोपण प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं। दाताओं की सीमित संख्या के कारण, केवल लगभग 2,400 प्रत्यारोपण अमेरिका में हर साल ² प्रदर्शन कर रहे हैं। जाहिर है, इस अंग की कमी के रूप में अन्य रणनीतियों transplanta के लिए अतिरिक्त अंगों का निर्माण करने के लिए आवश्यक हैं जरूरतों को संबोधित कियाtion और, आदर्श, इन अंगों के रूप में तो अस्वीकृति और जीवन भर प्रतिरक्षादमन से संबंधित जटिलताओं से बचने के लिए ऑटोलॉगस होगा।

स्तनधारी वयस्क cardiomyocytes चोट पर एक सीमित पुनर्योजी क्षमता का प्रदर्शन है, लेकिन हाल ही में सबूत से पता चलता है कि स्तनधारी नवजात दिलों चोट ^5-8 के बाद एक उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता बनाए रखने के लिए। विशेष रूप से, आंशिक शल्य लकीर के बाद, एक पुनर्योजी खिड़की जन्म और प्रसव के बाद दिन के बीच की खोज की गई है 7. इस पुनर्योजी अवधि fibrotic निशान की कमी है, neovascularization के गठन, epicardium से एन्जियोजेनिक कारकों की रिहाई, और cardiomyocyte प्रसार ^5-8 की विशेषता है ^11। समय की यह पुनर्योजी खिड़की एक bioartificial दिल के विकास के लिए सामग्री का एक उपन्यास स्रोत के रूप में नवजात दिल प्रयोग करने के लिए क्षमता प्रदान करता है।

बाह्य मैट्रिक्स महत्वपूर्ण संकेतों cardiomyocyt बढ़ावा देने के लिए प्रदान करने के लिए जाना जाता हैई प्रसार और विकास। नवजात और वयस्क matrices ¹² और उनके उत्थान को बढ़ावा देने की क्षमता में अणुओं की उपलब्धता में स्पष्ट मतभेद ¹³ का पता लगाया गया है। Decellularized वयस्क matrices कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है सेलुलर repopulation के लिए एक ईसीएम पाड़ और एक bioartificial दिल की पीढ़ी प्रदान करने के लिए। इन अध्ययनों, और स्टेम सेल प्रौद्योगिकियों में नई खोजों, तेजी से आगे बढ़ रहे हैं, वहीं कई बाधाओं को अभी तक पूरा किया जाना है। उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स दीवार में मैट्रिक्स के मूल संरचना, सेलुलर एकीकरण के संरक्षण में सीमाओं, और क्षमता प्रसार और विकास के सभी सीमा समर्थन करने के लिए इस दृष्टिकोण की सफलता। बेहतर पुनर्योजी गुण नवजात दिल के लिए जिम्मेदार माना गया है, इस तरह के एक ऊतक का उपयोग करने के व्यावहारिक पहलुओं को अपने अन्वेषण सीमित है।

नवजात दिल का प्रदर्शन किया पुनर्योजी क्षमता के आधार पर, हम एक विकसित करके उपन्यास matrices विकसित किया हैपी 3 माउस दिल के लिए decellularization की तकनीक। पी 3 दिल इन अध्ययनों के लिए चुना गया था के रूप में यह हृदय उत्थान की खिड़की के भीतर है, जैसा कि पहले ⁶ चुना गया लेकिन दिल फसल, decellularize और recellularize करने के लिए काफी बड़ी है। इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक नवजात माउस दिल से एक मैट्रिक्स बनाने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन है। हमारे अध्ययन करते हुए ईसीएम की संरचनात्मक और प्रोटीन अखंडता को बनाए रखने के लिए एक मिनट, नवजात दिल decellularizing की व्यवहार्यता के लिए सबूत प्रदान करते हैं। हम यह भी mCherry व्यक्त cardiomyocytes के साथ इस हृदय ईसीएम recellularize करने की क्षमता प्रदर्शित और हम Recellularization निम्नलिखित विभिन्न हृदय मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए इन cardiomyocytes की जांच की है। यह तकनीक एक bioartificial दिल के विकास के लिए एक नवजात मैट्रिक्स की श्रेष्ठता के परीक्षण के लिए अनुमति देगा।

Protocol

सभी माउस प्रयोगों अमेरिका पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और मिनेसोटा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। 1. माउस दिल अलगाव के लिए व…

Representative Results

decellularization औसत पर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक पी 3 दिल की decellularization के लिए समय लगभग 14 घंटा है। पी 3 नवजात शिशु के लिए 23 मिलीग्राम की एक औसत दिल वजन दिया। Acellularity चित्रा 3A…

Discussion

दिल के दोहराया perfusions पर इस तकनीक की निर्भरता एक दिल का आवेश के परिहार के एक सफल परिणाम के एक महत्वपूर्ण घटक बना देता है। कदम 2.2-2.6 में दिल की प्रारंभिक कैथीटेराइजेशन, कदम 2.8-2.14 के बीच समाधान के परिवर्तन के लिए, …

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.