Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

Summary

In questi studi, forniamo metodologia per nuovi, neonatali, impalcature cardiaci murini per l'uso in studi rigenerative.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

L'insufficienza cardiaca è comune e mortale. È una malattia progressiva che si traduce in una riduzione della contrattilità del cuore, che ostacola il flusso di sangue agli organi e lascia le richieste metaboliche del corpo insoddisfatte. Si stima che 5,7 milioni di americani hanno l'insufficienza cardiaca ed è la causa primaria di ospedalizzazione negli Stati Uniti ^9. Il costo collettivo di trattamento di pazienti in insufficienza cardiaca negli Stati Uniti supera i $ 300 miliardi di dollari l'anno ^9-10. L'unica terapia definitiva per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale è il trapianto di cuore ortotopico. Ogni anno, si stima che più di 100.000 cuori dei donatori sono necessari per le procedure di trapianto cardiaco negli Stati Uniti ^1-2. A causa del limitato numero di donatori, solo circa 2.400 trapianti vengono effettuati ogni anno negli Stati Uniti ^2. Chiaramente, questa carenza di organi deve essere affrontato come altre strategie sono tenuti a produrre organi aggiuntivi per il trapiantozione e, idealmente, questi organi sarebbe autologo in modo da evitare le complicazioni associate con il rifiuto e la durata immunosoppressione.

Cardiomiociti adulti mammiferi dimostrano una limitata capacità di rigenerazione su di infortunio, ma recenti evidenze suggeriscono che mammiferi cuori neonatali mantengono una notevole capacità rigenerativa dopo un trauma ^5-8. In particolare, dopo la resezione chirurgica parziale, una finestra rigenerativa è stato scoperto tra la nascita e postnatale giorno 7. Questo periodo rigenerativa è caratterizzata da una mancanza di cicatrice fibrotica, formazione di neovascolarizzazione, rilascio di fattori angiogenici dalla epicardio e cardiomiociti proliferazione ^{5-8 , 11.} Questa finestra rigenerativo di tempo fornisce il potenziale di utilizzo cuore neonatale quale nuovo fonte di materiale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale.

La matrice extracellulare è nota per fornire spunti importanti per promuovere cardiomyocyte la proliferazione e la crescita. Chiare differenze nella disponibilità di molecole nelle matrici neonatali e adulti ¹² e la loro capacità di promuovere la rigenerazione sono state esplorate ^13. matrici adulti decellularized sono stati utilizzati in diversi studi per fornire un ponteggio ECM per ripopolazione cellulare e la generazione di un cuore bioartificiale. Mentre questi studi, e le nuove scoperte nel campo delle tecnologie di cellule staminali, stanno avanzando rapidamente, diversi ostacoli devono ancora essere soddisfatte. Ad esempio, limitazioni nella preservando la struttura originaria della matrice, l'integrazione cellulare nella parete della matrice, e la capacità di sostenere la proliferazione e la crescita tutti i limiti del successo di questo approccio. Mentre gli attributi rigenerativa superiori sono state attribuite al cuore neonatale, gli aspetti pratici di utilizzo di un tessuto così hanno limitato la sua esplorazione.

Sulla base della capacità rigenerativa dimostrata del cuore neonatale, abbiamo sviluppato nuovi matrici sviluppando unatecnica di decellularization per il cuore P3 mouse. Il cuore P3 è stato scelto per questi studi in quanto è all'interno della finestra di rigenerazione cardiaca come precedentemente determinato ⁶ ma il cuore è grande abbastanza per il raccolto, decellularize e recellularize. L'obiettivo di questo studio è quello di dimostrare la fattibilità della creazione di una matrice da un cuore neonatale del mouse. I nostri studi forniscono prove per la fattibilità di decellularizing un minuto, cuore neonatale pur mantenendo l'integrità strutturale e proteica della ECM. Dimostriamo anche la capacità di recellularize questo ECM cardiaco con mCherry cardiomiociti che esprimono e abbiamo esaminato questi cardiomiociti per l'espressione di diversi marcatori cardiaci seguenti Recellularization. Questa tecnologia permetterà per la prova della superiorità di una matrice neonatale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale.

Protocol

Tutti gli esperimenti di topo sono stati eseguiti in conformità con Animal Welfare Act degli Stati Uniti e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università del Minnesota. 1. Metodo per l'isolamento Cuore mouse Euthanize un mouse neonatale per decapitazione con una sola lama utilizzo. Tampone torace con il 70% di etanolo. Sezionare la pelle dal petto tagliando via dalla parete toracica con le forbici standard, tirando la pelle…

Representative Results

decellularization In media, il tempo di decellularization di un cuore P3 utilizzando questo protocollo è di circa 14 ore. dato un peso medio di 23 mg di cuore per il neonato P3. Acellularity Figura 3a mostra un cuore neonatale completamente intatto P3 (tutto il monte). La figura 3b mostra lo stesso cuore seguente decellularization. Figure 4a e 4b</strong…

Discussion

La dipendenza di questa tecnica su ripetuto perfusione del cuore fa evitare un'embolia una componente critica di un esito positivo. Dal cateterizzazione iniziale del cuore nei passaggi 2.2-2.6, ai cambiamenti di soluzione tra Piazza 2.8-2.14, ci sono manipolazioni che possono permettere l'introduzione di bolle d'aria che compromettono il flusso di perfusato nel miocardio. A causa del peso ridotto cuore neonatale, anche bolle minute vascolarizzazione possono causare un infarto tecnica, rendendo il decellulari…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.