신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬
Summary
이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.
Abstract
The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.
Introduction
심부전은 일반적이고 치명적입니다. 그것은 기관에의 혈류를 저해하고, 신체의 대사 충족 수요를 남긴다 심장의 수축력 저하를 초래 진행성 질환이다. 570 만 미국인들이 심장 마비를 가지고있는 것으로 추정하고 미국 9 입원의 주요 원인이다. 미국에서 심장 마비 환자를 치료 집단 비용은 연간 9-10 당 $ (300) 억 달러를 초과합니다. 말기 심부전 유일한 최종 치료 동소 심장 이식이다. 매년, 10 만 명 이상의 기증자 마음이 미국 1-2에서 심장 이식 절차에 필요한 것으로 추정된다. 때문에 기증자의 제한된 번호 만 약 2,400 이식은 미국이 매년 수행됩니다. 분명히, 이러한 장기 결품 다른 전략 transplanta 추가 기관을 생산하는 데 필요한으로 해결되어야거부 평생 면역 억제와 관련된 부작용을 회피하기 위하여 기 및 이상적으로 이러한 장기자가있을 것이다.
포유류 성인 심근 부상에 따라 제한된 재생 능력을 보여하지만 최근의 증거는 포유류의 신생아 마음이 상해 5-8 다음과 같은 놀라운 재생 능력을 유지하는 것이 좋습니다. 특히, 부분적인 수술 적 절제 다음, 회생 창이 출생과 출생 후의 일 사이에 발견되었다 (7)이 회생 기간은 섬유 성 흉터의 부족, 신생 혈관의 형성, 심장 외막에서 혈관 신생 인자의 방출 및 심근 확산 5-8 특징 11. 시간이 회생 창이 bioartificial 심장의 개발을위한 신규 물질의 공급원으로 신생아 심장을 사용하는 가능성을 제공한다.
세포 외 기질은 cardiomyocyt를 촉진하는 중요한 단서를 제공하는 것으로 알려져E 증식 및 성장. 신생아 및 성인 행렬 (12) 및 재생을 촉진 할 수있는 능력 분자의 가용성에 뚜렷한 차이가 13을 탐구하고있다. Decellularized 성인 매트릭스 셀룰러 다시 채우기위한 ECM 지지체 및 bioartificial 심장의 생성을 제공하는 여러 연구에 사용되었다. 줄기 세포 기술이 연구 및 새로운 발견이 빠르게 발전하고 있지만, 몇 가지 장애물이 충족되어야 아직. 예를 들어, 매트릭스 벽으로 행렬의 기본 구조 셀룰러 통합 보존 한계 및 능력이 접근법의 성공 증식 및 성장은 모든 제한을 지원한다. 회생 특성이 우수 신생아 심장 기인되었지만, 이러한 조직을 사용하는 실용적인 측면은 탐색을 제한하고있다.
신생아 심장의 증명 재생 능력을 바탕으로, 우리는 개발을 통해 새로운 매트릭스를 개발했다P3 마우스 심장 탈세 포화의 기술. 이전에 6 결정하지만 마음 수확, decellularize 및 recellularize에 충분한 크기로는 심장 재생의 창 내에서 그대로 P3의 마음은이 연구를 위해 선택되었다. 이 연구의 목적은 쥐 신생아 심장에서 매트릭스를 생성하는 가능성을 입증한다. 우리의 연구는 ECM의 단백질 구조적 무결성을 유지하면서 분 신생아 심장 decellularizing의 가능성에 대한 증거를 제공한다. 우리는 또한 mCherry 표현 심근이 심장 ECM을 recellularize 할 수있는 능력을 보여 우리는 recellularization 다음과 같은 다양한 심장 마커의 발현이 심근을 조사했다. 이 기술은 bioartificial 심장의 개발 신생아 행렬의 우월성 시험을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마음의 반복 관류에이 기술의 의존도는 색전증을 피하기 성공적인 결과의 중요한 구성 요소를 만든다. 단계 2.8-2.14 사이의 솔루션의 변화 단계 2.2-2.6의 심장의 초기 카테터,에서, 어떤 타협 심근에 관류의 흐름을 기포의 도입을 허용 할 수 있습니다 조작이 있습니다. 때문에 신생아 심장의 소형 크기로, 혈관에 미세한 기포 따라서 불완전 탈세 포화 렌더링, 기술 경색의 원인이 될 수 있습니다. 또?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.
Materials
| 1. Materials For Mouse Heart Isolation | |||
| P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
| 60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
| Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
| Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
| Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
| 2. Materials For Decellularization | |||
| Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
| Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
| Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
| Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
| Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
| Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
| Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
| 60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
| Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
| 22g x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
| 12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
| 3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
| 22 x 1 g needle | BD | 305155 | or equivalent |
| PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
| Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
| 1X Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
| 3. Materials For DNA Quantitation | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30U/mg activity |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
| MgCl*6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
| Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
| 4. Method for fixation and sectioning of tissue. | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
| Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
| 5. Method for tissue histology | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
| Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
| Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
| Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
| Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
| Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
| α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
| mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
| NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
| Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
| Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
| Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
| Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
| 6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating. | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
| HEPES (1M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
| Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
| Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
| Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
| Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |
References
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