Introduction
Mevcut HIV-1 terapileri sınırlaması, kronik hastalığın ilerlemesini engellemek için de uygulanabilir olmasıdır. HIV-1 karşı T lenfosit veya hematopoietik kök hücre nakli, ilaç tedavisi 1,2 yokluğunda HIV-1 replikasyonu, uzun süreli kontrolünü sağlama potansiyeline sahiptir ve aynı zamanda, bir HIV-1 ilacı elde etmek için etkili bir yaklaşım olabilir 3.. HIV-1 replikasyonu dirençli hücre oluşturmak için bir yolu, otolog transplant 4 sırasında enfekte bireyin hücrelerine anti-HIV-1 RNA veya peptitler kodlayan bir ya da daha fazla gen eklemektir. Çeşitli aday anti-HIV-1 genlerinin herhangi bir tek genin HIV-1 direnç gelişmesini önlemek için, iki adet 5 ya da üç 6 kombinasyonları bazı giren klinik çalışmalarda dizayn edilmiştir.
Anti-HIV-1 RNA immün yanıtları ortaya çıkarmak için düşük potansiyel ve onlar için kombine gen terapisi için en iyi adaylar arasındaÇok kısa bir gen sekanslarından transkribe edilmektedir. Bazı anti-HIV-1 RNA, viral giriş ve bütünleşmesini hedeflemek üzere dizayn edilmiştir. Bununla birlikte, en anti-HIV-1 RNA, viral yaşam çevriminde sonrası entegrasyon adımlar (Şekil 1) hedefler. Sonrası entegrasyon inhibitörleri ribozimler 7, 8 ve shRNAs U1i RNA'lar 9 olarak, HİV-1 düzenleyici proteinleri tat veya rev 1 ve antisens dayalı RNA hedef HIV-1 RNA farklı sitesi hedef, yem RNA içerir. Anti-HIV-1 RNA etkinliğini karşılaştırmak için kullanılmış olan yöntemler genlerin aday RNA'lar kodlayan ve viral geçici aday RNA ifade eden plasmidler ile transfekte edilen hücrelerde üretim ve HIV-1 ifade plazmid ölçüm ile dönüştürülmüş hücrelerin viral replikasyonu izlenmesini, 10 -13. Daha önce yeni bir ribozim, hedef siteye 13-15 HIV-1 RNA taranması için bir HIV-1 üretimi deneyi kullandık. Bu yöntemler beri bir RNA biçimini optimize etmek için rafine edilmişgirişim molekülü, bir shRNA plazmid DNA'sından ifade edilen ya da sentetik bir siRNA 16 olarak verilir. Deney insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerinde olgun virüs üretimini ölçer ve (Şekil 1), HIV-1 replikasyon döngüsünde sonrası entegrasyon evreleri hedefleyen önleyicilerinin etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Ön entegrasyon basamakları hedefleyen inhibitörleri, böyle bir tzm-bl hücre enfektivite tahlil 17 gibi alternatif deneyler antiviral etkinliğini değerlendirmek için gereklidir.
Klinikte anti-HIV-1 RNA teslimi için önemli güvenlik kaygıları, insan RNA veya protein ve doğuştan gelen bağışıklık sensör aktivasyonu üzerindeki potansiyel hedef dışı etkiler bulunmaktadır. Anti-HIV-1 siRNA'lar toksisitesini değerlendirmek için, farklı hücre hatları 16 bir hücre canlılığı deneyi kullandık. Ayrıca, iki iplikçikli bir RNA bağışıklık sensörler aktivasyonu ölçülmüştür RNA aktive edilmiş protein kinaz R (PKR) reseptör 3 (TLR3) Toll benzeri gibi exinterferon pression geni ADAR1 P150 uyarılmış. Bu deneyler, anti-HIV-1 RNA etkinliği hücre canlılığı veya immün sensör aktivasyon dolaylı etkileri nedeniyle olmadığını teyit etmek için kullanılabilir. Ayrıca, daha da geliştirilmesi, potansiyel toksisite aday RNA'ların hariç yararlıdır.
Aşağıdaki protokollerde, prosedürler yeni tedavi RNA'lar belirlemek ve mevcut biçimi açıklanmıştır optimize etmek. Yöntemleri, HIV-1 replikasyonu tarama RNA temelli sonrası entegrasyon inhibitörleri için faydalı olan ve bu tür viral RNA 18 ya da CRISPR Rev aracılı ihracat hedefleme küçük moleküller gibi diğer sonrası entegrasyon inhibitörlerinin taranması için adapte edilebilir / tasarlanan Cas sistemleri entegre hedef HIV-1 DNA'sı 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre ve Transfeksiyonlar
- Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) içinde kültür HEK 293T hücreleri,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. Hücre kültürü ortamı içinde 2 x 10 5 hücre / ml'lik bir süspansiyon hazırlayın. Her çukuruna hücre süspansiyonundan 500, 100 ve 1000 ul, 24 oyuklu, 96 gözlü, 12 gözlü levhalar, viral üretimi, hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri sırasıyla (Şekil 2A) için.
- Yavaşça girdap plakalar ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de / Ç N onları kuluçkaya yatmaktadır. % 50-70 confluency hücreleri büyür.
- Bir transfeksiyon planına göre, 1.5 ml mikro tüpler (örneğin Şekil 2B) test RNA'lar ve kontrol seyreltileri hazırlanır.
- Viral üretimi deneyi için, bir HIV-1 ifade plazmidinin 10 ng / | il seyreltme hazırlanması ve her bir tüpe 10 ul ekle. Sonraki 5 uM test RNA'lar dilüsyonları ve negatif kontrol RN hazırlamakC. 25 ya da 100 nM nihai konsantrasyonlarda, ilgili tüplere her bir test RNA ve negatif kontrol seyreltme 2.5 ya da 10 ul ekle.
- C: Hücre canlılığı deneyi için 5 uM test RNA dilüsyonları ve pozitif kontrol RNA, düşük molekül ağırlıklı poli I bir 10 mg / ml seyreltme hazırlar. sırasıyla, 100 nM veya 200 ug / ml nihai konsantrasyonları, tekabül eden tüpler test RNA ya da pozitif kontrol RNA dilüsyonları 2 ul ekle.
- immün aktivasyon deneyi için, deney RNA veya adım 1.3.2 hazırlanan pozitif kontrol RNA dilüsyonları 20 ul ekle. sırasıyla, 100 nM veya 200 ug / ml nihai konsantrasyon, tekabül eden tüplere.
Aşama 1.3.1 ng 25 ve 100 nihai miktarda vererek, test RNA ekspresyon plazmidleri, deney RNA'lar 5 uM dilüsyonları yerine 10 ng / | il dilüsyonları hazırlamak: edin. 100 adım 1.3.2 ng. ve 1.3.3.
- Viral ürünler için, her transfeksiyon tüpüne DMEM 50, 25 ya da 75 ul eklesırasıyla uction, hücre canlılığı ve bağışıklık aktivasyon tahlilleri. Viral üretim deneyleri için, bir sonraki adımdan önce bir biyo-güvenlik seviyesi 3 (BSL3) laboratuvara hücreleri ve hazırlanan transfeksiyon tüpleri getirmek.
- transfeksiyon tüplerine transfeksiyon reaktif sırayla 2 ul ekleyin ve kompleksleri oluşturmak için izin vermek için 15 ila 20 dakika inkübe edin. Belirli transfeksiyon reaktif Malzemesi Tabloya bakınız kullanılacak.
- damla damla hücre kültür plakaları içinde karşılık gelen pozisyonlarda, her mikro tüp tamamını transfeksiyon karışımı ekleyin. Yavaşça girdap ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat süre ile inkübe edin.
- Hücre kültürü plakaları (Şekil 2C), HIV-1 üretimini (Bölüm 2), hücre canlılığı (bölüm 3) ve immün aktivasyon (bölüm 4) ölçün.
2. Viral Üretim Deneyi
- inkübatör 24-iyi hücre kültür plakaları çıkarın ve BSL-3 hücre kültürü içindeki girdap plakalar hafifçedavlumbaz. HIV-1 üretimini ölçmek için kullanılacak olan 96-gözenekli düz tabanlı plaka içinde de karşılık gelen her gözden üst fazın 150 ul aktarın.
Not: Genel viral miktar deneyleri, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), 20, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) 21 yoluyla viral RNA miktarının HIV-1 kapsid proteini (p24) ekspresyonunu ölçmek ve aktivitesinin ölçülmesi bulunmaktadır HIV-1 RT enziminin. 2.2 2.5 HIV-1 RT aktivitesinin 13,15,16 ölçmek için yöntemler açıklar Adımları. - Aktarım, bir viral bozulması kokteyli 15 (Tablo 1) 25 ul ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka gözenekleri içinde karşılık gelen süpernatan 5 ul. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı ve radyoaktivite iş istasyonuna plaka aktarın.
Not: Adım 2.2. Bir radyoaktivite iş istasyonu BSL3 laboratuarda mevcut değilse gereklidir. Plakalar kaldırılması gerekmiyorsaBSL3 laboratuar, 2.3 adıma geçin. ve radyoaktif kokteyl 25 ul yerine viral / radyoaktif bozulması kokteyli (Tablo 1) 50 ul ekle. - Radyoaktif bir kokteyl 15 (Tablo 1) Hazırlama ve viral süpernatan ve baskıyı kokteyl her çukuruna 25 ul ekle. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Nokta 5 cam elyaf Di Etil Amino Etil (DEAE) Filtermat kağıdı karşılık gelen kareler üzerine reaksiyon karışımının ul ve noktalar 10 dakika kurumasını bekleyin. hiçbir iki numune doğrudan birbirlerine yatılı böylece her meydanda reaksiyon karışımı nokta. Bu aşamada 2.6 dakikada (cpm) başına sayıları belirlerken örnekler arasında çapraz-over önlemeye yardımcı olur.
- Kağıtlar% 95 etanol ile iki kez 1 dakika yıkama yapılmıştır 2x tuzlu su, sodyum sitrat (SSC) tampon maddesi (Tablo 1) 5 dakika için 5 kat yıkayın. kağıtlar kurumaya ve örnek torbalarına bunları mühürlemek için izin verir.
- Klip örnek çanta coBir kaset içine Filtermat kağıt ntaining ve bir mikroplaka sintilasyon sayacı içine kaset takın. Deneyde kullanılan [32 P] dTTP parti için sağlanan referans tarihi ile 32 P cpm okumak için sayaç ayarlayın. plaka haritayı kullanarak okuma ve sayaç başlatmak için hangi örnekler seçin.
- herhangi bir virüs ölçümü yöntemi için, komşu negatif kontrol ile her test RNA için elde edilen değerler bölmek ve test RNA'ların her tekrarında HIV-1 üretiminin yüzde inhibisyonunu elde etmek için 100 ile bu değeri çarpın. Farklı konsantrasyonlarda farklı test RNA karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 3'te verilmektedir.
3. Hücre Canlılık Testi
- / Ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiyazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromid) Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su içinde seyreltildi (inkübatör, 96 gözlü levhalar çıkarın ve 5 mg 20 ul her bir kuyunun DPBS). f inkübeveya 37 ° C'de 3 saat.
- deterjan (% 1 NP-40, izopropanol içinde 4 mM HCI) her ile asitleştirildi izopropanol 150 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
- Bir mikrolevha spektrofotometre 570 nm'de absorbans belirler.
- bitişik transfeksiyon kontrolü ile her numune için elde edilen değer bölünerek, her pozitif kontrol ve test RNA göreceli MTT metabolizmasını hesaplayın. Farklı test RNA ve pozitif kontrol karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 4'te verilmektedir.
4. Bağışıklık Aktivasyon Testi
- inkübatör 12-kuyu plakaları kaldırmak ve kültür ortamı aspire. Yavaşça DPBS hücreler iki kez yıkayın ve her bir (proteaz ve fosfataz inhibitörleri, Tablo 1 de dahil olmak üzere), soğuk lisiz tamponu 22 70 ul ekle. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin.
- mikro tüpler hücre lizatları aktarın ve hızlı daldırarak bunları dondurmaksıvı nitrojen içinde borular. Numuneler Çözülme ve 3 olmak üzere toplam 2 daha donma çözülme döngüleri için tekrar izin verin.
- Hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 4 ° C'de, 15.700 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj lizatları. Yeni bir mikro tüpler süpernatantı aktarın ve Coomassie mavisi (Bradford) yöntemini 23,24 kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
- % 10 denatüre edici poliakrilamid jel içinde her bir numunenin proteinin 75 ug çözmek ve daha önce 25,26 tarif edildiği gibi bir nitroselüloz zara transfer.
- Bir membrana elektroforezi ve aktarımı sonra, iki kez distile su ile yıkama, ardından 1 dakika boyunca Ponceau S (Tablo 1) 'de membran inkübe edilerek protein bantları görülebilir. 80 ve 55 kDa zar kesmek için bir kılavuz olarak bantlar ve protein merdiven kullanın.
Not: Adım 4.4 örnekleri 16 x 18 cm 34 kDa aşağı 2 jelleri çalıştırılabilir, belirtilen pozisyonlarda membran kesip kesip değil kolay şekildeilgi bantları. Alternatif olarak, çeşitli jeller zarı kesme önlemek için aynı örnekleri ile çalıştırılabilir. - % 0.05 Tween 20 (TBST, Tablo 1) ihtiva eden Tris-tamponlu tuzlu su ile Ponceau S boyama yıkayın. Tamamen zarları kapsayan% 5 yağsız süt ile TBST ilave edin. 1 saat boyunca çalkalama ile, oda sıcaklığında membranlar inkübe edin.
- membranlar inkübe O / N ADAR1 (110 ve 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) ve fosfo-IRF3 (47-kDa) karşı 1,000'de 1 seyreltilmiş% 3 sığır serum albümini ile TBST (BSA) ve antikorlarda, sırasıyla membran, üst orta ve alt parçalar için.
- Membranlar TBST ile 5 dakika için 5 kat ve 1 saat (5,000 içinde 1 seyreltilmiş),% 5 yağsız süt ve peroksidaz-etiketli keçi anti-tavşan sekonder antikor ile TBST içinde inkübe yıkayın.
- TBST ile 5 dakika boyunca membranlar 5x yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre filmler bantları görselleştirmek için elektrokemiluminesan (ECL) çözümü uygulayın.
- filmler protein bantları görselleştirmek sonra bir antikor sıyırma çözeltisi ile 10 dakika boyunca zarın, orta ve alt parçaları yıkayın. ve IRF3 (500 'de 1 olarak), toplam PKR karşı% 3 BSA ile TBST içinde membranlar O / N ve antikor inkübe (1.000 de 1), sırasıyla, orta ve alt parçalar için. Yineleyin 4.8 adımları. ve 4.9. PKR membran (orta), anti-tavşan ikincil antikoru yerine peroksidaz etiketli keçi anti-fare kullanılmıştır.
- TBST ile 5 dakika için membran 5x alt parça yıkayın (5,000 içinde 1 seyreltilmiş) aktine karşı bir antikor ile 1 saat boyunca% 3 BSA ile TBST içinde membran inkübe edin. Yineleyin 4.8 adımları. ve 4.9. anti-tavşan sekonder antikor yerine peroksidaz etiketli keçi anti-fare kullanılmıştır. Farklı test RNA ve pozitif kontrol karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 5'te sağlanmaktadır. Kullanılacak özel antikorlar için Malzemelerin tabloya bakınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prosedürleri genel şematik bir üç test RNA ve Şekil 2B'de sağlanan bir kontrol RNA için bir örnek transfeksiyon planı, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Viral üretimi ve hücre yaşayabilirliği tahlilleri için, her bir test yapı için Okuması bir negatif kontrol normalize edilir. Her test RNA bitişiğindeki negatif kontrol normalize böylece çoğaltır, setler halinde transfekte edilir. Bu durum, örneğin, negatif kontroller tüm birinci transfekte edilir, eğer neden olabilir kompleks ve transfeksiyon arasındaki zaman, ilgili eksik veri önlemek için yapılır. HIV-1 bağışıklık tepkileri 27,28 etkileyebileceği için, hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri, bir HIV-1 eksprese eden plazmid ilave edilmeksizin gerçekleştirilmektedir.
HIV-1 RNA bir korunmuş sitesi (konum 1498-1415 hedefleme RNA interferans moleküllerinin optimal uzunluğu tanımlamak içinHIV-1 sarmalı NL4-3) 13 19, siRNA'lar bir dizi (Şekil 3A) tasarlanmıştır. HIV-1 üretimi testi kullanılarak, uzun Dicer alt-tabaka saçma siRNA ile transfekte edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında RT aktivitesinin yüzde (SINS) eksprese eden bir plazmid 100 ng ile ko-transfeksiyon, farklı miktarlarda her bir test siRNA ile transfekte edilen hücreler için hesaplanmıştır HIV-1 sarmalı NL4-3 (Şekil 3B).
Hücre canlılığı deneyi kullanılarak, MTT yüzdesi metabolizması Şekil 3B'de tanımlanan en etkili siRNA'lar ile transfekte edilen hücreler için belirlenmiştir. Veriler, tek başına transfeksiyon reaktifi (Şekil 4) ile muamele edilen hücrelerin MTT metabolizması normalize edildi. Uzun bir çift zincirli RNA (poli I: C) hücre canlılığı azaltılmış; Bununla birlikte, etkisi değerlendirilmiştir en yüksek dozda yalnızca önemli olmuştur. Hücre yaşam kabiliyetinde önemli bir azalma 1498 si hedefleme siRNA'lar gözlemlendi bağımsız olarak uzunluğu HIV-1 RNA te. Immün aktivasyon tahlili kullanarak, RNA, aynı resim potansiyel bağışıklık tepkileri (Şekil 5) tetiklemek için değerlendirildi. Poli I koşullarda C ADAR1 P150 ekspresyonunu ve PKR ve IRF3 arasında indüklenmiş fosforilasyonu aktifleştirilmiş bağışıklık aktivasyonu üzerine önemli bir etkisi Test RNA'ların herhangi gözlenebilir.
HIV-1 replikasyon döngüsünde öncesi ve sonrası entegrasyon adımları Şekil 1 şematik. Ön entegrasyon (1-3) ve post-entegrasyonu (4-7), HIV-1 replikasyon döngüsünün adımları tarif kutular içinde gösterilmektedir . Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
Viral üretimi, hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri Şekil 2 şematik (A). Plaka yapışan hücreler, 24 saat süre ile kültür. Hücreler 500, 100 12-yuvalı plakalar ve viral üretimi, hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri, hücre kültür ortamı 1000 ul sırasıyla de 24 kaplanmıştır 96- vb vardır. (B) 48 saat boyunca transfeksiyon tüpleri, transfect hücreleri ve kültür hazırlayın. üç test RNA'lar (RNA1-3) bir dizi için bir örnek transfeksiyon planı uygun kontrolleri ile gösterilir. transfeksiyon prosedürü de gösterilmiştir. (C) oku-out. Viral üretim, hücre canlılığı ve bağışıklık aktivasyon deneyleri için okuma-out yazılı ve bölümleri 2, 3 ve 4'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ P>
HIV-1 üretiminin test siRNA'lar Şekil 3. Etkisi. Farklı uzunluklarda ve simetrileri ile siRNA'lar (A) Tasarım. HIV-1 RNA (1498, hedef sitesi) muhafaza edilmiş bir dizi farklı uzunlukta (17 ila 29 nükleotid sens iplikleri) simetrik ve asimetrik siRNA'lar (si1498-) tasarlamak için kullanıldı. Beklenen anlamda (üst, siyah) ve antisens (alt, kırmızı) ipliklerini gösterilir. Si1498 uzunlukta türevleri HIV-1 üretimini (B) inhibisyonu. simetrik veya asimetrik si1498 uzunluğu türevleri ile transfekte HEK293T hücre üstte yüzen madde içindeki HIV-1 RT aktivitesinin yüzde (%) önleme, uzun Dicer alt-tabaka saçma siRNA (SINS) göre gösterilmiştir. Her bir test, RNA, iki ya da üç kez tekrarlanmış olan en az iki bağımsız transfeksiyonlardan farklı dozlarda SINS ile karşılaştırılmıştır. veri İfade vardırstandart hata araçlarının (SEM) ± ortalama değerler olarak Essed. Bu rakam, 16 modifiye edilmiş, Mikrobiyoloji telif hakkı American Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Si1498 uzunluğunun Şekil 4. etkisi, hücre canlılığı ile ilgili varyantları HEK293T hücreleri poli I ile transfekte edilmiştir. 100 nM'de si1498 50 ve 200 ug / ml, C (pIC50 ve PIC200) ve farklı uzunluklarda ve formatlar. MTT% metabolizması, iki ya da üç kez tekrarlanmış olan üç bağımsız transfeksiyonun yalnız transfeksiyon reaktifi (Mock, E) ile muamele hücrelere göre belirlendi. Veri SEM'ler ± ortalama değerler olarak ifade edilmiştir. Eşleştirilmemiş student t-testi farklı nakiller significantl olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştırY (*, P <0.05) sahte transfekte edilmiş hücrelerin azaltılmış hücre canlılığı göre. Bu rakam, 16 modifiye edilmiş, Mikrobiyoloji telif hakkı American Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Si1498 uzunluğunun Şekil 5. etkisi doğal immün yanıtları varyantları. HEK293T hücreleri pIC50, PIC200 ve farklı uzunluklarda ve 100 nM'de si1498 biçimleri ile transfekte edilmiştir. PKR ve TLR3 aktivasyonu, sırasıyla, fosforlu PKR ve IRF3 ölçülerek değerlendirildi. bir interferon uyarımlı gen (ISG) ifadesi yapıcı şekilde tanımlanmış varyantın, ADAR1 P110 göre ISG ADAR1 P150 seviyeleri ölçülerek değerlendirildi. aktin ekspresyonu, bir yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. bu figure 16'dan modifiye edilmiştir, Mikrobiyoloji telif hakkı American Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Tampon / reaktifi adı | kompozisyon |
| Viral bozulması kokteyl | 60 mM Tris-HCI, 75 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1.04 mM EDTA,% 1 NP-40 (1 M Tris-HCI, pH 7.8). |
| radyoaktif kokteyl | 60 mM Tris-HCI, 75 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1.04 mM EDTA, 10 ug / ml poli (A), 0.33 ng / ml oligo dT (1 M Tris-HCI, pH 7.8). Kullanımdan hemen önce eklendi: 8 mM ditiotreitol (DTT, Cı 4H 10 O 2S 2) ve 5 ul [32P] dTTP (3000 Ci / mmol) Kokteyl, her 500 ul için. |
| Radyoaktif / viral bozulma kokteyl | 60 mM Tris-HCI, 75 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1.04 mM EDTA,% 0.1 NP-40, 5 ug / ml poli (A), 0.16 ng / ml oligo (1 M Tris-HCI, pH 7.8) dt. Kullanımdan hemen önce eklendi: 8 mM ditiotreitol (DTT, Cı 4H 10 O 2S 2) ve kokteyl, her 1 ml 5 ul [32P] dTTP (3000 Ci / mmol) eklenir. |
| 2X SSC | 17.53 g NaCI ve 8.82 gr sodyum sitrat - 2H 2 O 1 LH 2 O. |
| liziz tamponu | 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA (1 M Tris-HCI, pH 7.4),% 10 h / h gliserol,% 1 h / h (0.5 M, pH 8.0) NP-40. |
| Ponceau S | 500 mi H2O içinde 2.5 g Ponceau S ve 5 ml asetik asit |
| TBST 6.05 g Tris, 8.76 g NaCl ve 1 ml Tween 20 1 LH 2 O. |
Tablo 1:. Ticari olmayan tamponlar ve reaktif bileşenleri tüm ticari olmayan tamponlar ve reaktifler için Tarifler sağlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tanımlanan HIV-1 üretimi deneyi HEK293T hücreleri (Şekil 2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve etkili bir ribozim 13 shRNA 10,29, siRNA 30 ve U1i RNA 11,31 hedef sitesi HIV-1 RNA taramak için kullanılan deneyler benzer edildi. HIV-1 üretimini ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılarak, çalışmaların çoğu, aday RNA'lar ile bir HIV-1 ifade plazmidinin Müşterek transfeksiyon sonrasında, virüs üretimini 48 saat ölçtük. HIV-1 üretiminin ardından, olgun virionlar, yeni hücreleri enfekte edebilen, olgun virionlar, olma, HIV-1 proteaz tarafından kendi poliproteinlerin proteolitik bölünme durumuna maruz kalır. adımda 2.2'de tanımlanan HIV-1 RT enzim aktivitesi deneyi için. RT enzimi olgun virionlar sadece aktif olduğundan 2.5'e., Üretim ve olgunlaşma aşamaları hem değerlendirilmektedir. Bunun aksine, kapsid proteini ve viral RNA hem olgun ve olgun olmayan viryonlar içinde mevcut olabilir. Bu nedenle, p24 ELISA ya da RT-PCR m, HIV-1 üretimini miktarınınAy, HIV-1 virionlar 32 ve HIV-1 proteini ifadesi 13 ek olarak, Gag işlenmesini inhibe antisens bazlı moleküller lokalize gibi ribozimler olarak, HİV-1 replikasyon döngüsünün olgunlaştırma aşamasına hareket terapötik RNA'lar etkilerini kaçırma 31. Viral üretimi deneylerinde bir sınırlaması kullanılan hücreler HİV-1 giriş için uygun reseptörlerini ifade etmez ve HIV-1 giriş ve entegrasyon terapötik RNA'ların etkilerini değerlendirmek için kullanılamaz olmasıdır.
Tüm replikasyon döngüsü üzerinde anti-HIV-1 RNA etkisini değerlendirmek için, çeşitli HIV-1 enfeksiyonu modelleri farklı T lenfosit hücre çizgileri veya birincil kan hücreleri 5,33 kullanılmıştır. Bu hücre çizgileri transfekte etmek zor olduğundan, bu tür lentiviral vektör, gen sokulması ya da aptamer / peptid konjugasyon daha fazla emek yoğun yöntemler HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkileri gözlemlemek için, anti-HIV-1 RNA'ların yeterli miktarlarının verilmesi için gereklidir. Bu sınırlama di yaparhızla, özellikle anti-HIV-1 RNA varyantları arasında yapı-aktivite ilişkileri karşılaştırma ya da anti-HIV-1 RNA, yeni sınıfları için en uygun hedef site belirlemek için geniş çaplı bir taramasını gerçekleştirmek üzere fficult. Viral üretim deneyler, bu tzm-BL hücreleri gibi HIV-1 replikasyonu destekleyen kolay transfekte edilmiş hücre hatları, yeni anti-HIV-1 RNA molekülleri, bir alternatif hücre modellerinde tanımlanması için faydalı olmasına rağmen, tarama için yararlı olacaktır, anti-HIV-1 böyle giriş ve entegrasyon gibi çoğaltma döngüsünde başka adımlar, hedef RNA'lar.
Anti-HIV-1 RNA sınıfına bağlı olarak, toksisite birçok potansiyel mekanizma anlatılmıştır. Örneğin, antisens bazlı RNA'lar HIV-1 RNA amaçlanan hedef siteye aynı veya benzer bir sekansı ihtiva eden selüler RNA üzerinde hedef dışı etkileri olabilir. Benzer şekilde, RNA aptamerler, trans-aktivasyon karşılık elemanının (TAR) ya da REV karşılık elemanı (RRE) biçiminde tasarlanmış, hücre pr fonksiyonunu etkileyebilirtar RNA bağlayıcı protein (TRBP) 34 olarak oteins. shRNAs ve siRNA'lar 36 kompleksi U1 küçük çekirdek RNA-protein proteinlerini kenetleme hücresel RNA eklenmesini ve işleme etkilediği gösterilmiştir kenetleme RNAi proteinleri 35 ve bazı U1i molekülleri RNA interferans yolunu etkileyebilir ilave potansiyeline sahiptir. Bu etkilerin bazıları dikkatli bir tasarım ile minimize edilebilir olsa da, yeni bir anti-HIV-1 RNA molekülleri için ekranlar hücresel toksisite ölçümleri daha da geliştirilmesi potansiyel hedef dışı etkileri olan moleküllerin dışında yararlıdır. Bundan başka, hedef dışı etkiler dolaylı HIV-1 üretimi ekranlarından tanımlanan yeni bir anti-HIV-1 moleküllerinin etkinliğini doğrulamak hücresel toksisite önemli ölçüm yapmak HIV-1 üretimini inhibe edebilir.
hücre canlılığı deneyi adımları 3.1 tarif edilmiştir. 3.4. Çeşitli anti-viral molekülü taranması için kullanılmış olan standart bir deneyle bir varyasyonudur 37 s. Deney formazan olarak, çözünmeyen mor renkli forma MTT ayıracı azaltmak için (P) H-bağımlı hücresel enzimler NAD aktivitesini ölçer. Protokol daha önce yayınlanmış yöntemlerden 38 uyarlanmıştır ve çeşitli kitler MTT ya da yakından ilgili reaktif kullanılarak elde edilebilir. Bu anti-HIV-1 RNA, tarama için kullanılan hücre hattı hücre canlılığı deneyi önemli olmakla birlikte, farklı hücre hatları RNA kaynaklı toksisitenin doğru duyarlılığına göre değişir unutulmamalıdır. Örneğin, Reynolds ve arkadaşları. Dicer alt-tabaka siRNA'lar MCF7, DU145 ve HeLa S3 hücreleri 39 herhangi bir HEK293T hücrelerinde hücre ömrü üzerindeki etkisi, ancak önemli ölçüde düşük hücre canlılığını sahip olduğunu göstermiştir. Burada tarif edilen analiz için, HEK293T hücreleri örnek (Şekil 4) olarak kullanılır; Bununla birlikte, aynı analiz aynı zamanda küçük RNA kaynaklı toksisitenin 16 daha duyarlı olan bir hücre hattı potansiyel toksisite değerlendirmek MCF7 hücrelerinde yapılmıştır.
Anti-HIV-1 RNA yana e_content "> işlenmiş ve anti-HIV-1 protein veya peptit ile karşılaştırıldığında, daha az imünojenik olarak kabul edilir adaptif bağışıklık sistemine sağlanmasını mümkün değildir. Ancak, dizi ya da yapıya bağlı olarak, doğuştan ortaya çıkarabilir bağışıklık tepkileri ve birkaç bağışıklık sensörler ve sinyal yolları burada açıklanan immün aktivasyon deneyinde. (40 gözden), küçük RNA'lar yanıt olduğunu tespit edilmiştir, fosforlu PKR ve IRF3 düzeyleri bir gibi küçük RNA'lar ile transfekte hücrelerde karşılaştırıldı PKR ya TLR3 aktivasyonunun göstergesi sırasıyla. Hem RNA sensörleri hücre çizgilerinin geniş bir yelpazede yer almaktadır ve bunların aktivasyon PKR, çeviride bir kapandığı durumda, tip 1 interferonlann üretimine yol açabilmektedir. değerlendirmek Anti-HIV-1 RNA için potansiyel alternatif yollar 1 interferonlann tür üretim aktif hale getirmek için, interferon uyarımlı gen ADAR1 (P150) seviyeleri de transfekte hücre karşılaştırıldıAnti-HIV-1 RNA. Uzun dsRNA'nın pozitif kontrol etkileri gösterdiği gibi, poli I: C, bu yanıtların tümünü (Şekil 5) HEK293T hücrelerde aktif olduğunu ve benzeri etkiler MCF7 hücrelerinde 16 gözlendi. Bu yanıtlar, hücre canlılığı ile ilgili etkiler olmadan HIV-1 üretimini engelleyen olabilir için, immün aktivasyon tahlili, yeni anti-HIV-1 RNA etkinliği için ek doğrulama içerir. Bu değerlendirme eklenebilir daha fazla ölçümler enflamatuvar sitokinlerin üretiminin ölçülmesi ve hücre kültürü süpematantı içinde 1 interferon türü ve diğer interferon uyarımlı gen ekspresyonunu ölçmek içerir. CD4 + T hücreleri ve makrofajlar HIV hedef hücreler doğuştan gelen bağışıklık sensörler farklı düzeylerde eksprese edebilir için, bu protokolde tarif edilen tahlillerden tanımlanan aday ayrıca hücre tiplerinin potansiyel bağışıklık uyarımı için değerlendirilmelidir.tahlillerin hepsi tarif içind tekrarlanabilir ve doğru sonuçlar elde etmek için kritik bir adım DNA veya RNA transfeksiyon tüplerin hazırlanmasıdır (1.3 adım.). konsantrasyonları doğru olarak belirlenebilir plazmid DNA ya da RNA, yüksek saflıkta olmalıdır. Aynı zamanda, uygun kontroller dahil etmek önemlidir. Viral üretimi deneyinde yeni test RNA ekspresyon plazmidleri değerlendirmek için uygun bir negatif kontrol boş ekspresyon plazmididir. Antisens bazlı RNA'lar için olmayan bir hedefleme RNA eksprese eden ek bir negatif kontrol plazmidi de dahil edilmelidir. HIV üretimi etkilemez olmayan bir hedefleme ribozim için diziler ve shRNA 13'te verilmiştir. Test siRNA'lar için kullanılabilecek tek negatif kontrol olmayan bir hedefleme RNA ve 16 sağlanan virüs üretimi deneyi için uygun bir sigara hedefleme siRNA dizisidir. hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri için, negatif kontrol hücreleri tek başına transfeksiyon reaktifi ile muamele ve c olmalıdırCı hücrelerin RNA-bağlı zehirlilik ve immün aktivasyon duyarlı olduğunu teyit etmek için dahildir: örneğin poli I gibi bir pozitif kontrol olduğu ritical. RNA ekspresyon plazmidleri için, boş plazmid vektörü, aynı zamanda kendisini hücreler üzerinde toksik etkilere sahip olmadığından emin olmak için dahil edilmelidir.
Genel olarak, burada tarif edilen deneyler, HIV-1 geninin ya da ilaç terapisinde kullanım için emin ve etkili bir RNA terapisi tanımlanması doğru iyi bir ilk adım temsil etmektedir. HIV-1 RNA hedefleme molekülleri, bir önceki 15 yayınlanmış dizisi koruma hesaplamak için HIV-1 suşlarının, dolaşımdaki ve ayrıntılı yöntemler, hedef bölgenin korunması dikkate almak da önemlidir. Klinik çalışmalarda içine doğru bir molekül taşımak için, uzun süreli toksisite ve etkinlik çalışmaları tanımlanan aday güvenli ve klinik olarak etkili olacağını teyit etmek için, birincil insan hücrelerinin ve hayvan modellerinde yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Burada sunulan çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (DCB-120266, PPP-133377 ve AG için HBF-348967 verir).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A.
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M.
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
