Introduction
Sporulazione nel lievito erba è stata studiata per fornire approfondimenti molti aspetti della biologia, compreso il controllo della segregazione cromosomica durante la meiosi 1, meccanismi di ricombinazione genetica 2, il controllo dello sviluppo da cellule segnalazione 3, controllo nutrizionale di sviluppo 4, il trascrizionale regolazione dello sviluppo 5, e l'esame di formazione di spore 6. Formazione di spore include un nuovo evento divisione cellulare coinvolge la formazione di nuovi compartimenti di membrana all'interno della cellula madre seguita dalla deposizione di un muro di spore di protezione 6. Questi studi che esaminano le cellule sporulanti spesso approfittano della rapida sporulanti ceppo di lievito SK1, che può subire il processo di sporulazione in circa 24 ore in modo relativamente efficiente 7,8. Anche se l'ottimizzazione delle condizioni di sporulazione per gemmazione di lievito sono state descritte 9-13, questi esperimentis esaminato sporulazione su mezzi solidi o in colture liquide scala più ampia in cui è effettuata la sporulazione utilizzando tubi di coltura o flaconi.
Qui si descrive un metodo per sporulanti lievito in un formato piatto pozzetti 96. Troviamo che per questo metodo, aerazione è fondamentale per sporulazione sincrona ed efficiente, e hanno ideato tecniche per assicurare sporulazione sufficiente un formato multipozzetto piccolo volume. Sporulanti in un formato 96 pozzetti piatto permette alle cellule di essere sottoposti a screening utilizzando tecniche high-throughput e reagenti ottimizzati per un formato piatto multipozzetto, tale screening per soppressori di alta copia utilizzando una libreria di piastrelle 14-16.
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Protocol
1. Preparazione per Sporulazione
Nota:. I media descritti in questo protocollo sono realizzati con ricette e metodi standard di 13,17 La tabella 1 riporta la formulazione per 1 L di vari supporti utilizzati in questo protocollo.
| Bacto Peptone | Estratto di lievito | Bacto Agar | Destrosio | Acetato di potassio | glicerina | DDH 2 O | |
| piastre YPG | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 ml | 970 ml |
| piastre YPD | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1.000 ml |
| YPD liquido | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1.000 ml |
| YPA liquido | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1.000 ml |
| mezzi sporulazione | - | - | - | - | 10 g | - | 1.000 ml |
Tabella 1:. Formulazioni media importi vengono forniti 1 l di media. Specifiche su supportiingredienti possono essere trovati nella Tabella Materials.
- Se tutte le celle sporulanti sarà lo stesso genotipo, seguire questa procedura:
- Scongelare ceppo di lievito da utilizzare su un (YPGlycerol) Piastra YPG. Grow lieviti per 12-16 ore a 30 ° C. È importante sottolineare che le cellule SK1 sono anche pronti a sporulare, in modo da ceppi SK1 non dovrebbero essere lasciati troppo a lungo su piatti YPG, o possono sporulare sul piatto.
Nota: Un ceppo appena scongelati coltivate su YPG è preferito, come l'utilizzo di glicerolo come fonte di carbonio richiede fosforilazione ossidativa, e sceglie quindi per cellule che hanno DNA mitocondriale funzionale. cellule SK1 hanno una tendenza a perdere DNA mitocondriale funzionale e diventare petites. DNA mitocondriale funzionale è necessario per sporulazione. - Streak lievito dalla piastra YPG su un (YPDextrose) piastra YPD per singole colonie. Crescere lievito sulla piastra YPD 24-28 ore a 30 ° C.
- Dopo circa 36-48 ore di crescita su YPD supporto solido, avviare una cultura di 25 ml YPD utilizzando una singola coloniadalla piastra YPD. Crescere questa cultura fino a quando le cellule sono circa 600 OD = 4,0-7,0. Eseguire questo passaggio a 30 ° C per una notte in un incubatore agitazione, agitazione a 220 giri al minuto.
- Dalla cultura YPD, utilizzare una quantità appropriata di cellule per iniziare a 1.000 ml di YPA (YPAcetate) cultura che è OD 600 = 0,1 per ogni esigenza 96 pozzetti nella sezione 2. crescere il lievito in una agitazione incubatore a 30 ° C (agitazione a 220 rpm) fino a quando la coltura OD 600 è compreso tra 1,3 a 1,5.
Nota: Seminare 100 ml di cultura YPA per ogni piatto pozzetti 96 a proiettato nella sezione 2. Per esempio, se lo screening quattro 96 piastre a pozzetti multipli, saranno necessari 400 ml di cultura YPA. A partire con il 10% in più di volume nella cultura YPA è necessario per proteggere contro la perdita di volume per evaporazione. Tipicamente, ci vorranno tra 12-16 ore per le cellule per raggiungere il diametro esterno adeguato 600; la quantità di tempo può variare a seconda del genotipo del ceppo di lievito. YPA è il supporto presporulation. Pregrowthin acetato aiuta inducono l'espressione di geni (ad esempio IME1) necessario per sporulazione efficiente e sincrona 6. - Spin a 1.800 xg in una centrifuga da tavolo per 5 minuti per far sedimentare le cellule coltivate in YPA. Lavare le cellule 1x con 0,5 volume di acqua deionizzata sterile in autoclave. Spin di nuovo, e scartare lavare. Risospendere le cellule in 1x supporto del volume sporulazione. Continuare alla Sezione 2.
- Scongelare ceppo di lievito da utilizzare su un (YPGlycerol) Piastra YPG. Grow lieviti per 12-16 ore a 30 ° C. È importante sottolineare che le cellule SK1 sono anche pronti a sporulare, in modo da ceppi SK1 non dovrebbero essere lasciati troppo a lungo su piatti YPG, o possono sporulare sul piatto.
- Se si utilizza cellule per sporulazione che sono di diversi genotipi, (vale a dire, trasformate con diversi plasmidi o contenenti diverse mutazioni, in genere ottenuti e memorizzati come scorte congelate), le cellule matrice dei diversi genotipi in un formato pozzetti 96. Quindi, seguire questa procedura:
- Utilizzare uno sterile Frogger 96 poli per trasferire le cellule provenienti dalle scorte congelate scongelati a 96 pozzetti piastra (s) sul YPG terreni solidi. Crescere durante la notte di lievito a 30 ° C.
- Utilizzando uno sterile frogger 96 poli, trasferire le cellule dal YPG terreni solidi su supporti solidi YPD o selettivomezzi solidi (cioè, terreno minimo sintetico privo aminoacidi, se le celle contengono plasmidi che richiedono la selezione). Grow lievito a 30 ° C fino colonie si formano per ogni ceppo, in genere almeno 1 giorno in YPD e 2 giorni se terreni selettivi è necessario.
- Aliquotare 1,2 ml di terreno liquido YPD o supporti liquidi selettivi in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 96 profonde 2 ml. Trasferire le cellule da supporti solidi in liquidi utilizzando una Frogger, coprire con un coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro adesivo, e crescere durante la notte in 30 ° C shaker, agitando a 220 giri al minuto.
Nota: Per ridurre al minimo la contaminazione, piastre di copertura utilizzando i coperchi di plastica da una piastra di Petri rettangolare. Tenere coperchi in posto con un pezzo di nastro, in modo che la circolazione dell'aria è minimamente limitata. - piastre centrifugare a 1.800 xg per 5 minuti, utilizzando un secchio centrifuga oscillante con gli adattatori per accogliere 96 pozzetti. Eliminare i media dalle cellule; aggiungere 500 microlitri YPA a ciascun pozzetto e sospendere nuovamente le cellule pellet nel YPA. Copertinacon coperchio in plastica trattenuta da nastro.
- Crescere le cellule per 15 ore a 30 ° C in un incubatore agitazione, agitazione a 220 rpm. Continuare alla Sezione 2.
2. Le cellule sporulanti in un multiwell formato 96
- Aggiungere uno dei due 3 millimetri perle di vetro solido sterile o un sterili 5 mm x 2 mm ancoretta magnetica in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 con 1,3 ml di pozzi. (Vedere Rappresentante Risultati al di sotto per una discussione sull'opportunità di usare una perlina o un ancoretta.)
- Se tutte le celle da schermati sono dello stesso genotipo, vai a 2.2.1. Se le cellule per essere schermati sono di diversi genotipi, andare a 2.2.2.
- Prendere le cellule dal punto 1.1.5 e un'aliquota 500 ml di cellule più supporti in ciascun pozzetto della piastra di pozzetti 96. Coprire con il coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro. Procedere alla 2.3.
- cellule Spin che sono YPA da 1.2.4 a 1800 xg per 5 minuti, utilizzando un secchio centrifuga oscillante con adattatori per ospitare piastre da 96 pozzetti. versare dif supporti dalle cellule. Aggiungere 500 ml di mezzi sporulazione in ciascun pozzetto e sospendere nuovamente le cellule pellet nei media sporulazione. Coprire con il coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro. Procedere alla 2.3.
- Se si utilizza un perle di vetro, luogo campioni in un incubatore agitazione a 30 ° C e agitare a 220 rpm per sporulazione. Se si utilizza un ancoretta magnetica, I campioni su un piatto mescolare all'interno di un incubatore a 30 ° per la sporulazione.
Nota: La velocità esatta mescolate per i bar mescolare magnetiche non è molto importante, a patto che tutte le barre si muovono con energia e la cultura è aerato. - Per monitorare la progressione attraverso la sporulazione, prelevare campioni dalla cultura sporulanti per la visualizzazione, Aggiungere 6 ml di cellule dalle culture sporulanti a 24 ml di media sporulazione in una piastra da 96 pozzetti coprioggetto (diluizione 1: 5). Lasciare le cellule accontentarsi di 5 minuti prima di esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito.
Nota: In cellule SK1 wild-type, compatti spore mature formeranno da 36 ore dopo il trasferimento su un supporto sporulazione. La progressione attraverso sporulazione può essere monitorato tramite microscopia utilizzando marcatori fluorescenti, come ad esempio un marcatore nucleare (cioè, Htb2-mCherry 18) per esaminare la divisione meiotica o un marcatore di membrana prospore (vale a dire, G20 19) per esaminare spore morfogenesi. In alternativa, la formazione di spore rifrangenti può essere visto utilizzando Nomarski microscopia DIC partire da circa 12 ore dopo il trasferimento sul supporto sporulazione.
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Representative Results
Per valutare questo protocollo, efficienze sporulazione ottenuti da sporulanti cellule in piastre a pozzetti multipli (come descritto sopra) sono stati confrontati con cellule sporigeni utilizzando volumi maggiori in beute (Tabella 2). L'uso di piastre a pozzetti multipli non ha raggiunto l'alta efficienza visto quando sporulanti in fiaschi, in cui l'efficienza ~ 80% può essere visto di routine. Sporulanti in piastre a pozzetti multipli con una corretta aerazione (fornito da perline di vetro o agitatori) può raggiungere efficienze sufficienti sporulazione superiore al 50%, con i migliori risultati (efficienza 66%) ottenuto utilizzando a 5 mm stir x 2 mm. Un rappresentante della sporulazione due ceppi diversi (wild type e smk1Δ) è mostrato qui (Figura 1). Queste cellule vengono esaminate dopo 36 ore nei media sporulazione e visualizzati tramite una piastra di fondo 96 di vetro bene.
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Figura 1:. Sporulanti cellule da un rappresentante sporulazione wild type e smk1Δ celle 20 sporulata in piastre da 96 pozzetti. Le cellule sono state visualizzate utilizzando un obiettivo 63X su un microscopio invertito. Tetradi rifrangenti (frecce) possono essere visti nella cultura wild type, ma non nella coltura contenente cellule smk1Δ. Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Sporulazione è stato testato utilizzando un 5 millimetri o 7 mm ancoretta, ciascuna delle quali si inserisce all'interno del pozzetto di una 96 1,3 ml piastra multipozzetto (Tabella 2). Utilizzando un ancoretta 7 millimetri portato a scarsa efficienza sporulazione (28%) rispetto al maggiore efficienza (66%), ottenuta utilizzando l'ancoretta 5 mm. L'ancoretta 7 mm di un pozzo tendeva a interagire con un ancoretta in unn pozzo adiacente (Figura 1), impedendo le barre dal poter mescolare correttamente e fornire un'adeguata aerazione della cultura.
| cellule sporulanti (%) | SEM (%) | |
| pallone in shaker | 82 | 1.8 |
| nessun tallone in shaker | 17 | 2.4 |
| cordolo in shaker | 56 | 3 |
| non ancoretta sul piatto mescolare | 10 | 2.2 |
| 5 mm mescolare bar piatto mescolare | 66 | 3.9 |
| 7 mm mescolare bar piatto mescolare | 28 | 6.7 |
| SEM = errore standard della media |
Tabella 2:Efficienze sporulazione utilizzando condizioni diverse. Sporulazione è stata condotta in 96 piastre multipozzetto così come descritto sopra, oppure, se osservato, in 500 ml flaconi contenenti 50 ml di mezzi di sporulazione. Otto pozzetti differenti sono stati in media per ogni condizione effettuato in una piastra multipozzetto. Tre palloni diversi stati sporulata. Tutte le culture sono replicati tecnici, ha iniziato dalla stessa colonia di Htb2 mCherry-tag ma tipo altrimenti selvaggio diploide SK1 ceppo di lievito (LH902 18). Queste cellule sono state coltivate in una singola boccetta di YPD e un singolo pallone di YPA, e poi diviso per inoculare piastre a 96 pozzetti contenenti supporti sporulazione, come descritto sopra. efficienza sporulazione è stata determinata contando spore rifrangenti 36 ore dopo il trasferimento su un supporto sporulazione utilizzando Nomarski DIC campo chiaro microscopia.
Figura 2: Stirbar in 96 1,3 ml piastre a pozzetti multipli. cultura sporulazione contenenti sia (a) il 5 x 2 mm stir barre (rossi) o (B) Bar 7 millimetri x 2 mm saltati (blu) in un piatto multipozzetto 96 1,3 ml su un ancoretta magnetica piatto. Barra di scala = 10 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui vi presentiamo un protocollo per sporulanti SK1 lievito in un formato di pozzetti 96. L'aerazione è la chiave per la sporulazione efficiente, che richiede l'utilizzo della propria ancoretta o una perla di vetro in ogni pozzetto. Quando le cellule sono sporulata in una piastra multipozzetto 96 in un incubatore agitazione senza né una perlina o ancoretta, le cellule non sporulino in modo efficiente. Solo un piccolo aumento dell'efficienza sporulazione è visto quando le cellule sono sporigeni senza né un cordone o ancoretta in un incubatore agitazione, rispetto ad essere a 30 ° C senza agitazione (Tabella 1; 17% in shaker vs 10% collocato su un stir piatto). Allo stesso modo, l'uso di una ancoretta 7 millimetri portato a scarsa efficienza sporulazione (28%), probabilmente perché i 7 mm mescolare bar non aerare la cultura correttamente a causa di interazioni con bar Mescolare in pozzi adiacenti. Questo protocollo descrive le condizioni per sporulazione utilizzando il modo sincrono ed efficiente sporulanti SK1 ceppo di lievito 7,8 comunemente usati per studiare sporulation; efficienze sporulazione che possono essere ottenuti con altri ceppi di lievito che utilizzano questo protocollo dovrebbero essere esaminate prima di intraprendere un grande schermo utilizzando queste tecniche.
Anche se a 5 mm x 2 mm risultati ancoretta in un sporulazione leggermente migliore rispetto all'utilizzo di un perle di vetro (66% con 5 millimetri ancoretta x 2 mm vs 56% con un perle di vetro), il costo richiesto per l'acquisto abbastanza scalpore barre per ciascun pozzetto può essere proibitivo. Le efficienze sporulazione ottenuti utilizzando una perlina di vetro fornisce una soluzione a basso costo che crea sufficiente aerazione per lo screening high-throughput in un formato multipozzetto 16 96. Purtroppo, l'aggiunta di una barra agitatrice o una perlina di vetro non ha raggiunto le efficienze sporulazione molto elevate (tipicamente ~ 80% o superiore) visto quando sporulanti in fiaschi, e fenotipi sporulazione così sottili può essere difficile da rilevare quando lo screening in un 96 ben formato.
A differenza dei metodi sporulazione precedentemente descritti 9-13
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione Joseph P. Healey presso la University of Massachusetts Boston (LSH) e R15 GM86805 dal NIH (LSH). SMP è sostenuto in parte da una Sanofi-Genzyme Fellowship presso l'Università del Massachusetts di Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
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