Introduction
La sporulation chez la levure en herbe a été étudié pour donner un aperçu de nombreux aspects de la biologie, y compris le contrôle de la ségrégation des chromosomes lors de la méiose 1, les mécanismes de recombinaison génétique 2, le contrôle du développement par la cellule de signalisation 3, contrôle nutritionnel du développement 4, la transcription régulation du développement 5, et l'examen de la formation de spores 6. La formation de spores comprend un événement de division cellulaire nouvelle impliquant la formation de nouveaux compartiments à l' intérieur de la membrane de la cellule mère , suivie par le dépôt d'une paroi protectrice 6 spores. Ces études qui examinent les cellules sporulantes profitent souvent de la souche de levure sporulation rapidement SK1, qui peut subir le processus de sporulation dans environ 24 heures de façon relativement efficace 7,8. Bien que l' optimisation des conditions de sporulation de la levure bourgeonnante ont été décrits 13/09, ces expériencess examiné sporulation sur des supports solides ou dans les grandes cultures liquides à grande échelle où sporulation est effectuée en utilisant des tubes de culture ou flacons.
Nous décrivons ici un procédé pour la sporulation de la levure dans un format de plaque multipuits 96. Nous constatons que, pour ce procédé, l'aération est essentielle pour la sporulation synchrone et efficace, et ont mis au point des techniques pour assurer une sporulation suffisante d'un format multi-puits de faible volume. Sporuler dans un format de plaque multipuits 96 permet de cellules devant être criblés en utilisant des techniques à haut débit et des réactifs optimisés pour un format de plaque multipuits, un tel criblage pour des suppresseurs de copies élevé en utilisant une bibliothèque de tuiles 14-16.
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Protocol
1. Préparation de sporulation
Remarque:. Les milieux décrits dans ce protocole sont réalisés en utilisant des recettes et des méthodes standard 13,17 Le tableau 1 donne la formulation pour 1 L des différents médias utilisés dans ce protocole.
| bactopeptone | Extrait de levure | gélose Bacto | Dextrose | L'acétate de potassium | Glycérol | ddH 2 O | |
| plaques GPJ | 20 g | 10 g | 20 g | - | - | 30 ml | 970 ml |
| des boîtes de YPD | 20 g | 10 g | 20 g | 20 g | - | - | 1000 ml |
| liquide YPD | 20 g | 10 g | - | 20 g | - | - | 1000 ml |
| liquide YPA | 20 g | 10 g | - | - | 20 g | - | 1000 ml |
| médias sporulation | - | - | - | - | 10 g | - | 1000 ml |
Tableau 1:. Formulations des médias Les montants sont donnés pour 1 L de médias. Spécificités sur les médiasles ingrédients peuvent être trouvés dans la table des matières.
- Si toutes les cellules sporulantes sera le même Génotype, suivez cette procédure:
- la souche de levure Thaw à utiliser sur un (YPGlycerol) plaque GPJ. Cultivez levure pour 12-16 heures à 30 ° C. Fait important, les cellules SK1 sont également prêts à sporuler, donc les souches SK1 ne doivent pas être laissés trop longtemps sur des plaques de GPJ, ou ils peuvent sporuler sur la plaque.
Remarque: Une souche fraîchement décongelé cultivée sur YPG est préféré, que l'utilisation du glycérol comme source de carbone nécessite la phosphorylation oxydative, et sélectionne ainsi les cellules qui ont l'ADN mitochondrial fonctionnel. les cellules SK1 ont tendance à perdre de l'ADN mitochondrial fonctionnel et devenir petites. L'ADN mitochondrial fonctionnelle est nécessaire pour la sporulation. - Streak levure à partir de la plaque de GPJ sur un YPD (YPDextrose) plaque pour des colonies isolées. Cultiver la levure sur la plaque YPD 24-28 h à 30 ° C.
- Après environ 36-48 h de la croissance sur YPD milieux solides, démarrer une culture YPD 25 ml en utilisant une seule coloniede la plaque YPD. Cultivez cette culture jusqu'à ce que les cellules sont sur DO 600 = 4,0 à 7,0. Effectuez cette étape à 30 ° C pendant la nuit dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute.
- De la culture YPD, utiliser une quantité appropriée de cellules pour démarrer 1000 ml de YPA (YPAcetate) culture qui est DO 600 = 0,1 pour chaque besoin plaque à 96 puits dans la section 2. Cultiver la levure dans un incubateur agitateur à 30 ° C (agitation à 220 rpm) jusqu'à ce que la DO600 de la culture est compris entre 1,3 et 1,5.
Note: inoculer 100 ml de culture LPJ pour chaque plaque multipuits 96 à cribler dans la section 2. Par exemple, si le dépistage quatre 96 plaques multipuits, 400 ml de culture LPJ seront nécessaires. A partir de 10% du volume supplémentaire dans la culture LPJ est nécessaire pour protéger contre la perte de volume par évaporation. En règle générale, il faudra compter entre 12-16 h pour les cellules pour atteindre la DO appropriée 600; la durée peut varier en fonction du génotype de la souche de levure. LPJ est le média de présporulation. préculturedans de l' acétate aide induire l' expression des gènes (comme IME1) nécessaire pour efficace et synchrone sporulation 6. - Spin à 1.800 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min pour sédimenter les cellules cultivées dans LPJ. Laver les cellules 1x avec 0,5 volume d'eau désionisée autoclavée stérile. Spin à nouveau, et jeter laver. Resuspendre les cellules dans les médias 1x volume de sporulation. Continuer à la section 2.
- la souche de levure Thaw à utiliser sur un (YPGlycerol) plaque GPJ. Cultivez levure pour 12-16 heures à 30 ° C. Fait important, les cellules SK1 sont également prêts à sporuler, donc les souches SK1 ne doivent pas être laissés trop longtemps sur des plaques de GPJ, ou ils peuvent sporuler sur la plaque.
- Si l' utilisation de cellules pour sporulation qui sont des génotypes différents, (c. -à- transformées avec des plasmides différents ou contenant différentes mutations, généralement obtenues et stockées sous forme de stocks congelés), des cellules de tableau des différents génotypes dans un format 96 multipuits. Ensuite, suivez cette procédure:
- Utilisez un 96 broches frogger stérile pour transférer des cellules à partir de stocks congelés décongelés dans 96 plaque (s) multipuits sur YPG milieux solides. Cultiver la levure pendant la nuit à 30 ° C.
- Utilisation d'un 96 broches frogger stérile, transférer les cellules de YPG milieux solides sur YPD milieux solides ou sélectiveun milieu solide ( par exemple, un milieu minimal synthétique dépourvu des acides aminés, si les cellules contiennent des plasmides qui nécessitent une sélection). Cultiver la levure à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies sont formées pour chaque souche, typiquement 1 jour sur YPD et 2 jours si des milieux sélectifs est nécessaire.
- Aliquoter 1,2 ml de milieu liquide YPD ou des milieux liquides sélectifs dans chaque puits d'une plaque multipuits 96 profondeur de 2 ml. Transfert des cellules à partir de supports solides dans des milieux liquides en utilisant un frogger, couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban, et de croître pendant une nuit dans 30 ° C shaker, agitation à 220 rpm.
Remarque: Pour minimiser la contamination, des plaques de couverture en utilisant les couvercles en plastique à partir d'une boîte de Pétri rectangulaire. Tenir les paupières en place au moyen d'un morceau de ruban adhésif, de sorte que la circulation de l'air est très peu limité. - plaques centrifuger à 1800 xg pendant 5 min, en utilisant un seau centrifuge oscillant avec des adaptateurs pour accueillir plaques à 96 puits. Décanter médias de cellules; ajouter 500 ul LPJ à chaque puits et resuspendre cellules sédimentées dans la LPJ. Couvertureavec couvercle en plastique maintenu en place par un ruban.
- Cultiver les cellules pendant 15 heures à 30 ° C dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. Continuer à la section 2.
2. Les cellules sporulantes dans un 96 Multiwell Format
- Ajouter un ou l'autre de 3 mm perle de verre solide stérile ou un stériles 5 mm x 2 mm barre d'agitation magnétique dans chaque puits d'une plaque de 96 puits avec 1,3 ml de puits. (Voir résultats représentatifs ci - dessous pour une discussion sur l' opportunité d'utiliser un cordon ou d' une barre d'agitation.)
- Si toutes les cellules à cribler sont du même génotype, aller à 2.2.1. Si les cellules à cribler sont de différents génotypes, aller à 2.2.2.
- Prenez des cellules de l'étape 1.1.5 et aliquote de 500 pi de cellules plus les médias dans chaque puits de la plaque multipuits 96. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3.
- les cellules de spin qui sont LPJ de 1.2.4 à 1800 g pendant 5 min, en utilisant une centrifugeuse à godet oscillant avec des adaptateurs pour recevoir des plaques à 96 puits. verser def support de cellules. Ajouter 500 ul de milieu de sporulation dans chaque puits et les remettre en suspension les cellules sédimentées dans le milieu de sporulation. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3.
- Si vous utilisez une perle de verre, placer les échantillons dans un incubateur sous agitation à 30 ° C et agiter à 220 rpm pour la sporulation. Si vous utilisez une barre d'agitation magnétique, placer les échantillons sur une plaque d'agitation à l'intérieur d'un 30 ° C incubateur pour sporulation.
Remarque: La vitesse d'agitation exacte pour les barres d'agitation magnétique est pas très important, aussi longtemps que toutes les barres se déplacent énergiquement et la culture est aéré. - Pour surveiller la progression à travers la sporulation, prélever des échantillons de la culture sporulée pour la visualisation, Ajouter 6 ul de cellules à partir des cultures sporulées à 24 pi de milieu de sporulation dans une plaque à 96 puits lamelle couvre-objet (1: 5 de dilution). Laisser les cellules se contenter de 5 minutes avant d'examiner les cellules en utilisant un microscope inversé.
Remarque: Dans les cellules SK1 de type sauvage, les spores matures compacts formeront par 36 heures après le transfert aux médias de sporulation. La progression à travers la sporulation peut être contrôlée par microscopie en utilisant des marqueurs fluorescents, comme un marqueur nucléaire (c. -à -HTB2 mCherry 18) pour examiner la méiose ou un marqueur de la membrane ProSpore (c. -à- G20 19) pour examiner la morphogenèse des spores. En variante, la formation de spores réfringents peut être vu à l'aide de DIC Nomarski microscopie à partir d'environ 12 heures après le transfert au milieu de sporulation.
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Representative Results
Pour évaluer ce protocole, l' efficacité de sporulation obtenus à partir de cellules sporulantes dans des plaques multipuits (comme décrit ci - dessus) ont été comparées à des cellules sporulées en utilisant des volumes plus importants dans des flacons (tableau 2). L'utilisation de plaques multipuits n'a pas atteint le rendement élevé vu quand sporulation dans des flacons, où ~ 80% d'efficacité peut être régulièrement vu. Sporulation dans des plaques multipuits avec une bonne aération (fournies par des billes de verre ou des barres d'agitation) peut atteindre des rendements de sporulation suffisamment supérieure à 50%, avec les meilleurs résultats (66% d'efficacité) obtenue en utilisant une barre d'agitation x 2 mm 5 mm. Un sporulation représentant de deux souches différentes (de type sauvage et smk1Δ) est montrée ici (Figure 1). Ces cellules sont examinés après 36 h dans les médias de sporulation et visualisées en utilisant une plaque de fond 96 en verre bien.
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Figure 1:. Sporulation cellules à partir d' un sporulation représentant type sauvage et smk1Δ cellules 20 sporulés dans un 96 plaques multipuits. Les cellules ont été visualisées en utilisant un objectif 63X sur un microscope inversé. Tétrades réfractiles (pointes de flèche) peut être vu dans la culture de type sauvage, mais pas dans la culture contenant des cellules smk1Δ. Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Sporulation a été testé en utilisant soit un 5 mm ou 7 mm barre d'agitation, dont chacun correspond à l' intérieur du puits de 96 1,3 ml plaque multipuits (tableau 2). En utilisant une barre d'agitation 7 mm a donné lieu à l'efficacité de sporulation pauvres (28%) par rapport à la plus grande efficacité (66%) obtenue en utilisant la barre d'agitation de 5 mm. La barre d'agitation 7 mm dans un puits a eu tendance à interagir avec une barre d'agitation dans unn puits adjacent (figure 1), ce qui empêche les barres de pouvoir mélanger et fournir une aération adéquate de la culture correctement.
| les cellules sporulantes (en%) | SEM (%) | |
| flacon dans un shaker | 82 | 1.8 |
| aucune bille dans un shaker | 17 | 2.4 |
| perle dans un shaker | 56 | 3 |
| aucune barre d'agitation sur la plaque d'agitation | dix | 2.2 |
| 5 mm remuent bar sur la plaque d'agitation | 66 | 3.9 |
| 7 mm remuent bar sur la plaque d'agitation | 28 | 6.7 |
| SEM = erreur standard de la moyenne |
Tableau 2:L' efficacité de la sporulation , en utilisant des conditions différentes. Sporulation a été réalisée dans des plaques à 96 puits à puits multiples tel que décrit ci - dessus, ou, si indiqué, dans des flacons de 500 ml contenant 50 ml de milieu de sporulation. Huit puits différents ont été moyennées pour chaque condition réalisée dans une plaque multipuits. Trois flacons différents ont été sporulés. Toutes les cultures sont répétitions techniques, ont commencé à partir de la même colonie de HTB2 mCherry marqués mais le type sauvage autrement SK1 diploïde souche de levure (LH902 18). Ces cellules ont été cultivées dans un seul flacon de YPD et un seul flacon de APY, puis divisé pour inoculer des plaques à 96 puits contenant un milieu de sporulation tel que décrit ci-dessus. l'efficacité de sporulation a été analysée par comptage des spores réfractiles 36 heures après le transfert aux médias de sporulation utilisant Nomarski DIC microscopie en fond clair.
Figure 2: Stirbars dans 96 1,3 ml plaques multipuits. culture sporulation contenant soit (A) 5 mm x 2 mm barres d'agitation (rouge) ou (B) des barres 7 mm x 2 mm d'agitation (bleu) dans une plaque multipuits 96 1,3 ml sur un agitateur magnétique assiette. Barre d' échelle = 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous présentons ici un protocole de sporulation SK1 levure dans un format de 96 multipuits. Aération est la clé pour la sporulation efficace, ce qui nécessite l'utilisation soit d'un barreau d'agitation ou une perle de verre dans chaque puits. Lorsque les cellules sont sporulés dans une plaque multipuits 96 dans un incubateur à agitation sans soit une perle ou une barre d'agitation, les cellules ne sporulation pas efficacement. Seule une petite augmentation de l'efficacité de la sporulation est observée lorsque les cellules sont sporulés sans soit une perle ou une barre d'agitation dans un incubateur à agitation, par rapport à l' être à 30 ° C sans agitation (tableau 1, 17% dans un shaker vs 10% placé sur un émoi assiette). De même, l'utilisation d'une barre d'agitation 7 mm a donné lieu à l'efficacité de sporulation pauvres (28%), probablement parce que les 7 mm remuent barres n'aèrent la culture correctement en raison d'interactions avec les barres d'agitation dans les puits adjacents. Ce protocole décrit les conditions de sporulation utilisant le synchroniquement et efficacement sporulation SK1 souche de levure 7,8 utilisée couramment pour étudier sporulation; l'efficacité de la sporulation qui peuvent être obtenus avec d'autres souches de levures qui utilisent ce protocole devraient être examinés avant d'entreprendre un grand écran en utilisant ces techniques.
Bien qu'un 5 mm x 2 mm les résultats de la barre d'agitation dans un peu mieux sporulation par rapport à l'utilisation d'une perle de verre (66% avec 5 mm x 2 mm barre d'agitation vs 56% avec une perle de verre), le coût nécessaire pour acheter suffisamment de bruit barres pour chaque puits peuvent être prohibitifs. Les rendements de sporulation obtenus en utilisant une bille de verre offre une solution à faible coût qui crée assez d' aération pour le criblage à haut débit dans un format multipuits 96 16. Malheureusement, l'ajout d'une barre d'agitation ou une perle de verre n'a pas atteint l'efficacité de sporulation très élevées (typiquement ~ 80% ou plus) vu quand sporulation dans des flacons, et phénotypes de sporulation ainsi subtiles peut être difficile à détecter lors de la sélection dans un 96 puits format.
Contrairement aux méthodes précédemment décrites 9-13 sporulation
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention Joseph P. Healey de l'Université du Massachusetts à Boston (LSH) et R15 GM86805 du NIH (LSH). SMP est supporté en partie par une Sanofi-Genzyme Fellowship à l'Université du Massachusetts à Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular Petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
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