Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
Die quartäre Struktur eines Proteins spielt eine entscheidende Rolle in vielen zellulären Prozessen. Signalwege, Genexpression und Enzym Aktivierung / Deaktivierung alle verlassen sich auf die korrekte Montage von Proteinkomplexen 1-4. Dieser Prozess auch als Homo- oder Hetero-Oligomerisierung bekannt, ist auf irreversible kovalente oder reversible elektrostatische und hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen. Oligomerisierung nicht nur diversifiziert die verschiedenen zellulären Prozessen , ohne die Genomgröße zunimmt, sondern bietet auch eine Strategie für Proteine stabile Komplexe zu bauen , die beständiger sind gegenüber Denaturierung und Abbau 5. Defekte in Oligomerisierung wirken sich auf die Funktion von Proteinen und können zur Entwicklung von Krankheiten führen. Beispielsweise bildet das Enzym Phenylalaninhydroxylase eines tetrameren Komplexes. Einige Mutationen innerhalb des Proteinkomplexes können die Tetramerbildung schwächen und führen zu der Krankheit Phenylketonurie 6.
<p class = "jove_content"> Die menschliche MxA Protein ein Interferon (IFN) -induzierten Protein antivirale Effektor ein breites antivirale Aktivität gegen verschiedene RNA als auch DNA – Viren 7 ausübt. Es gehört zur Superfamilie der dynamin artigen großen GTPasen und hat die Fähigkeit , in vitro 8 große oligomere Strukturen zu bilden. Die Oligomerisierung wurde vorgeschlagen , 9,10 M · A vor einem schnellen Abbau zu schützen. Trotz intensiver Bemühungen von vielen Forschungsgruppen bleibt der molekulare Wirkmechanismus weitgehend ungeklärt und die Rolle des Oligomerisierungszustand von M · A für seine antivirale Funktion ist umstritten 9,11,12. In dieser Hinsicht Gao und Mitarbeitern vorgeschlagen , ein Modell , in dem M · A durch die Interaktion mit viralen Nukleoproteine in Form von großen ringartigen oligomeren Strukturen 11 seine antivirale Aktivität ausübt. Jedoch in jüngerer Zeit zeigten wir , dass MxA Dimere antivirale Aktivität aufweisen und mit dem Nukleoprotein von Influenza A Virus 12 interagieren. Basierend auf der Kristallstruktur von M · A, Gao und Mitarbeitern identifiziert mehrere Aminosäurereste in den Grenzflächenbereichen , die 11,13 für die Oligomerisierung in vitro und seine antivirale Funktion wichtig sind. Daher wird, um zu erläutern, welche oligomere Zustand MxA antivirale Aktivität ausübt, haben wir versucht, ein einfaches Protokoll zu schaffen, um schnell die oligmeric Zustand MxA Schnittstelle Mutanten in menschlichen Zellen als auch ausgedrückt bestimmen als endogene MxA nach IFN & alpha; Anregung ausgedrückt.Obwohl es viele Techniken gibt, die die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu untersuchen , wie die Split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) Komplementations – Assay 14, Oberflächenplasmonresonanz 15 und Förster – Resonanzenergietransfer (FRET) 16 häufig verwendet werden, bieten sie nicht Informationen über die genaue Stöchiometrie eines oligomeren Proteinkomplex. Zur Untersuchung dieser besonderen Aspekt Techniken wieMehrwinkellichtstreuung (MALS) 17 und analytische Ultrazentrifugation 18 sind sehr nützlich. Normalerweise analysiert die Proteine mit Hilfe dieser Methoden sind gereinigte Proteine. Oligomerisierungsverfahren kann auch auf anderen zellulären Faktoren abhängen. Wenn diese Faktoren nicht bekannt sind, ist die Analyse schwieriger. Zusätzlich sind einige Proteine schwierig in E. auszudrücken coli und zu reinigen. Daher sind diese Verfahren nicht die optimale Wahl Protein Oligomerisierung in der zellulären Umgebung zu analysieren. Zusätzlich erfordern diese Techniken teure Instrumente, die nicht leicht verfügbar sind.
Nicht-denaturierende Polyacrylamid – Gelelektrophorese (PAGE), size exclusion chromatography oder chemische Vernetzung durch herkömmliche Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE gefolgt sind nützliche Werkzeuge für die Charakterisierung der Bildung von Oligomeren aus Zelllysaten 2,19,20. Diese Methoden erfordern keine spezielle Ausrüstung und kann leicht pe seinin einem Standard-Labor rformed. Wir haben uns zunächst verschiedene chemische Vernetzungsprotokolle ausgewertet, die invariant führte zu unspezifischen Aggregation und Ausfällung von M · A. Deshalb testeten wir als nächstes nicht denaturierende PAGE-Protokolle. Als nicht-denaturierende PAGE die Verwendung von SDS ausschließt, hängt die Migration von Proteinen auf ihre Mutter Ladung. Blau-native PAGE verwendet Coomassie Brilliant Blue G250 Proteine zu laden mit einer insgesamt negativen Ladung, ähnlich wie SDS, aber nicht denaturiert das Protein 21. Leider Coomassie Brilliant Blue Präzipitate in Gegenwart hoher Salze und divalente Kationen (zB Mg 2+) , die häufig in Lysepuffer enthalten sind. In Abhängigkeit von den verwendeten Puffer, kann es schwierig sein, die Probe ohne weitere Optimierung von Schritten zu analysieren, die eine Wirkung auf dem oligomeren Proteinkomplex haben.
Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll basiert auf einem zuvor veröffentlichten Verfahren 22 , um zu bestimmen OligomerisierungMensch MxA Protein aus Zellysaten abgeleitet unter Verwendung von nicht-denaturierende PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die in Säugetierzellen durch nicht-denaturierende PAGE, gefolgt von Western-Blot-Analyse ausgedrückt die schnelle Bestimmung des oligomeren Zustand von Proteinen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass die oligomeren Zustand eines bestimmten Proteins können ohne vorherige Proteinreinigung aus ganzen Zelllysaten bestimmt werden. Dies kann für Proteine wichtig sein, die ihre Funktion in Verbindung mit Hilfsfaktoren oligomerisieren oder ausüben. Darübe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
