Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
A estrutura quaternária de uma proteína desempenha um papel crucial em muitos processos celulares. Vias de sinalização, a expressão do gene e enzima de activação / desactivação todos contam com a montagem adequada de complexos de proteínas 1-4. Este processo também conhecido como homo- ou hetero-oligomerização é devido à covalente irreversível ou interacções proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversíveis. A oligomerização não só diversifica os diferentes processos celulares sem aumentar o tamanho do genoma, mas também fornece uma estratégia para construir proteínas de complexos estáveis que são mais resistentes à desnaturação e degradação no sentido 5. Defeitos na oligomerização ter um impacto sobre a função de proteínas e pode levar ao desenvolvimento de doenças. Por exemplo, a enzima fenilalanina hidroxilase forma um complexo tetramérico. Algumas mutações dentro do complexo de proteína pode enfraquecer a formação tetrâmero e conduzir à doença fenilcetonúria 6.
<p class = "jove_content"> A proteína MxA humano é um interferão (IFN) induzida por proteína efectora antiviral exercendo uma ampla actividade antiviral contra diversos ARN, bem como vírus de ADN 7. Ela pertence à superfamília de grandes GTPases dinamina semelhante e tem a capacidade para formar grandes estruturas oligoméricas 8 in vitro. A oligomerização tem sido sugerido para proteger da degradação rápida MxA 9,10. Apesar dos intensos esforços por vários grupos de pesquisa, o mecanismo molecular de ação permanece difícil e o papel do estado de oligomerização de MxA para a sua função antiviral está em debate 9,11,12. A este respeito, Gao e colegas propuseram um modelo onde MxA exerce a sua actividade antiviral, interagindo com nucleoproteínas virais em forma de grandes estruturas oligoméricas em forma de anel 11. No entanto, mais recentemente, demonstrou-se que os dímeros MXA exibem actividade antiviral e interagir com a nucleoproteína do vírus influenza A 12. Bduziu sobre a estrutura de cristal de MxA, Gao e colaboradores identificaram vários resíduos de aminoácidos nas regiões de interface que são críticos para a sua oligomerização in vitro e a sua função antiviral 11,13. Portanto, a fim de elucidar qual oligomérica estado de MxA exerce atividade antiviral, procurou-se estabelecer um protocolo simples para determinar rapidamente o estado oligmeric de mutantes de interface MXA expressos em células humanas, bem como endógena MxA expressa após a estimulação IFN.Embora existam muitas técnicas que são comumente usados para investigar a interação entre proteínas, tais como a proteína split-Verde Fluorescente (split-GFP) ensaio de complementação 14, ressonância de plasma de superfície 15 e Förster transferência de energia de ressonância (FRET) 16, eles não fornecem informações da estequiometria exacta de um complexo de proteína oligomérica. Para a investigação deste aspecto particular, tal como técnicasmulti-ângulo de espalhamento de luz (MALS) 17 e 18 de ultracentrifugação analítica são muito úteis. Geralmente, as proteínas analisadas usando estes métodos são proteínas purificadas. processos de oligomerização pode também depender de outros fatores celulares. Se estes factores são desconhecidas, a análise é mais difícil. Além disso, algumas proteínas são difíceis de expressar em E. coli e de purificar. Por conseguinte, estes métodos não são a escolha óptima para analisar a oligomerização de proteínas no meio celular. Além disso, essas técnicas exigem instrumentos dispendiosos que não estão facilmente disponíveis.
Não electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE), cromatografia de exclusão por tamanho ou por reticulação química convencional seguido de dodecil sulfato de sódio (SDS) -Página são ferramentas úteis para a caracterização da formação de oligómeros a partir de lisados de células 2,19,20. Estes métodos não requerem equipamento especializado e podem ser facilmente PErformed num laboratório padrão. Nós inicialmente avaliados vários protocolos químicos de reticulação que invariavelmente levaram a agregação e precipitação de MxA não específica. Portanto, o próximo testados protocolos PRINCIPAL não desnaturante. Como não-PAGE desnaturante exclui a utilização de SDS, a migração das proteínas depende da sua carga nativa. PAGE nativa utiliza-Azul de Coomassie G250 azul brilhante para carregar proteínas com uma carga global negativa, semelhante a SDS, mas não desnaturar a proteína de 21. Infelizmente, precipitados coomassie azul brilhante na presença de altas sais e catiões divalentes (por exemplo, Mg 2+) que são muitas vezes incluídos em tampões de lise. Dependendo dos tampões utilizados, pode ser difícil de analisar a amostra sem mais passos de optimização que podem ter um efeito sobre o complexo de proteína oligomérica.
Aqui é apresentado um protocolo simples baseado num método anteriormente publicado em 22 para determinar de oligomerizaçãoproteína MxA humana derivada a partir de lisados celulares usando não desnaturante PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui um método simples que permite a determinação rápida do estado oligomérico de proteínas expressas em células de mamíferos por PAGE não desnaturante seguido por análise Western Blot. A principal vantagem desta abordagem é que o estado oligomérico de uma dada proteína pode ser determinada a partir de lisados de células inteiras sem purificação de proteína antes. Isto pode ser importante para proteínas que oligomerizar ou exercem a sua função em associação com factores auxiliares…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
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