Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
La estructura cuaternaria de una proteína juega un papel crucial en muchos procesos celulares. Vías de señalización, la expresión del gen de la enzima, y la activación / desactivación de todos se basan en el correcto montaje de complejos de proteínas 1-4. Este proceso también conocido como homo- o hetero-oligomerización se debe a covalente irreversible o interacciones proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversibles. La oligomerización no sólo diversifica los diferentes procesos celulares sin aumentar el tamaño del genoma, sino que también proporciona una estrategia para las proteínas para construir complejos estables que son más resistentes a la desnaturalización y la degradación 5. Los defectos en la oligomerización tienen un impacto en la función de las proteínas y pueden conducir al desarrollo de enfermedades. Por ejemplo, la enzima fenilalanina hidroxilasa forma un complejo tetrámero. Algunas mutaciones dentro del complejo de proteínas pueden debilitar la formación de tetrámeros y conducir a la enfermedad fenilcetonuria 6.
<p class = "jove_content"> La proteína MxA humano es un interferón (IFN) inducida por proteína efectora antiviral ejerciendo una amplia actividad antiviral contra diversos RNA, así como los virus de ADN 7. Pertenece a la superfamilia de GTPasas grandes dynamin-como y tiene la capacidad de formar grandes estructuras oligoméricas in vitro 8. La oligomerización se ha sugerido para proteger MxA de degradación rápida 9,10. A pesar de intensos esfuerzos de muchos grupos de investigación, el mecanismo molecular de acción sigue siendo difícil de alcanzar en gran medida y el papel del estado de oligomerización de MxA para su función antiviral es objeto de debate 9,11,12. En este sentido, Gao y colaboradores propusieron un modelo en el que MxA ejerce su actividad antiviral mediante la interacción con nucleoproteínas virales en forma de grandes estructuras oligoméricas de anillo 11. Sin embargo, más recientemente, hemos demostrado que los dímeros MXa exhiben actividad antiviral e interactuar con la nucleoproteína del virus de influenza A 12. segundoobre la base de la estructura cristalina de MxA, Gao y colaboradores identificaron varios residuos de aminoácidos en las regiones de interfaz que son críticos para su oligomerización in vitro y su función antiviral 11,13. Por lo tanto, con el fin de dilucidar el cual oligomérica estado de MxA ejerce una actividad antiviral, hemos tratado de establecer un protocolo sencillo para determinar rápidamente el estado oligmeric de mutantes de interfaz MXa expresadas en las células humanas, así como endógenas MxA expresó después de la estimulación IFN.Aunque hay muchas técnicas que se utilizan comúnmente para investigar la interacción entre las proteínas tales como la proteína de split-verde fluorescente (split-GFP) ensayo de complementación 14, la resonancia de plasmón de superficie 15 y Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) 16, que no proporcionan la información de la estequiometría exacta de un complejo de proteínas oligoméricas. Para la investigación de este aspecto particular, las técnicas tales comodispersión de luz multiángulo (MALS) 17 y 18 de ultracentrifugación analítica son muy útiles. Por lo general, las proteínas analizadas usando estos métodos son proteínas purificadas. procesos de oligomerización también pueden depender de otros factores celulares. Si estos factores son desconocidos, el análisis es más difícil. Además, algunas proteínas son difíciles de expresar en E. coli y de purificar. Por lo tanto, estos métodos no son la elección óptima para analizar la oligomerización de proteínas en el medio ambiente celular. Además, estas técnicas requieren instrumentos caros que no son fácilmente disponibles.
La no electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE), cromatografía de exclusión por tamaño o reticulación química seguido de dodecil sulfato de sodio convencional -PAGE (SDS) son herramientas útiles para la caracterización de la formación de oligómeros a partir de lisados de células 2,19,20. Estos métodos no requieren equipo especializado y pueden ser fácilmente performed en un laboratorio estándar. Inicialmente se evaluaron varios protocolos de reticulación químicos que invariantly llevaron a la agregación y precipitación de MxA no específica. Por lo tanto, próximo a prueba los protocolos PAGE no desnaturalizante. Como PAGE no desnaturalizante excluye el uso de SDS, la migración de las proteínas depende de su carga nativo. PÁGINA Blue-nativo utiliza Coomassie G250 azul brillante para cargar las proteínas con una carga global negativa, similar a SDS, pero no desnaturaliza la proteína 21. Desafortunadamente, Coomassie precipitados azules brillantes de la presencia de niveles altos de sales y cationes divalentes (por ejemplo, Mg 2+) que a menudo se incluyen en tampones de lisis. Dependiendo de los tampones usados, puede ser difícil de analizar la muestra sin una mayor optimización de pasos que podrían tener un efecto en el complejo de proteína oligomérica.
Aquí se presenta un protocolo simple basado en un método previamente publicado 22 para determinar oligomerización deMxA proteína humana derivada de lisados celulares usando PAGE no desnaturalizante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un método sencillo que permite la rápida determinación del estado oligomérico de proteínas expresadas en células de mamífero por PAGE no desnaturalizante seguido de análisis de transferencia de Western. La principal ventaja de este enfoque es que el estado oligomérico de una proteína dada se puede determinar a partir de lisados de células enteras sin purificación de la proteína anterior. Esto puede ser importante para las proteínas que oligomerizar o ejercen su función en asociaci?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
