This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
המבנה הרביעון של חלבון ממלא תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. מסלולי איתות, ביטוי גנים, ואנזים הפעלה / ביטול הפעלה כל מסתמכים על ההרכבה הנכונה של קומפלקסי חלבונים 1-4. תהליך זה ידוע גם בשם שָׁוֶה או-oligomerization הטרו נובע קוולנטי בלתי הפיך או הידרופובי אלקטרוסטטית הפיך אינטראקציות חלבון-חלבון. Oligomerization לא רק מגוונת את תהליכים תאיים שונים מבלי להגדיל את גודל הגנום, אלא גם מספק אסטרטגיה חלבונים לבנות מתחמי יציבה כי הם עמידים יותר כלפי denaturation והשפלה 5. פגמים oligomerization להשפיע על תפקודם של חלבונים והוא יכול להוביל להתפתחות של מחלות. לדוגמה, hydroxylase פנילאלנין האנזים יוצר מורכבות tetrameric. כמה מוטציות במתחם חלבון יכול להחליש את היווצרות tetramer ולהוביל פנילקטונוריה מחלת 6.
<p class = "jove_content"> חלבון MxA האדם הוא אינטרפרון (IFN) -induced חלבון מפעיל אנטי הפעלת פעילות אנטי רחבה נגד RNA השונה וכן נגיפי DNA 7. היא שייכת superfamily של GTPases גדול דמוי dynamin ויש לו את היכולת ליצור מבנים oligomeric גדול במבחנה 8. Oligomerization הוצע להגן MxA מפני השפלה המהירה 9,10. למרות ניסיונות נמרצים מצד קבוצות מחקר רבות, את המנגנון המולקולרי של פעולה נותר חמקמק בעיקר ואת תפקידה של מדינת oligomerization של MxA לתפקוד אנטי שלה נמצא תחת דיון 9,11,12. בהקשר זה, גאה ועמיתים לעבודה הציעו מודל שבו MxA מפעיל הפעילות אנטי שלה על ידי אינטראקציה עם נוקלאופרוטאינים ויראלי בצורה של מבני oligomeric גדולים דמוית טבעת 11. עם זאת, ולאחרונה, הראינו כי הדימרים MxA תערוכת פעילות אנטי אינטראקציה עם nucleoprotein של נגיף שפעת A 12. Based על המבנה הגבישי של MxA, גאו ועמיתים לעבודה זיהו מספר שאריות חומצת אמינו באזורי ממשק כי הם קריטיים עבור oligomerization שלה במבחנה ותפקוד אנטי שלה 11,13. לכן, על מנת להבהיר הקובעות oligomeric של MxA מפעיל פעילות אנטי, ביקשנו להקים פרוטוקול פשוט במהירות כדי לקבוע את המצב oligmeric של מוטציות ממשק MxA לידי ביטוי בתאים אנושיים, כמו גם אנדוגני MxA הביע לאחר גירוי IFNα.אמנם יש טכניקות רבות שאינם בשימוש נפוץ כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבונים כגון החלבון המפוצל גרין פלורסנט (פיצול-GFP) assay השלמה 14, תהודת plasmon משטח 15 והעברת אנרגית תהודת פורסטר (סריג) 16, הם אינם מספקים מידע של stoichiometry המדויק של קומפלקס חלבוני oligomeric. לקבלת חקירה של היבט מסוים זה, טכניקות כגוןפיזור רב-זווית אור (יונקים) 17 ו ultracentrifugation אנליטית 18 הם מאוד שימושיים. בדרך כלל, את החלבונים נותחו באמצעות שיטות אלה הם חלבונים מטוהרים. תהליכי oligomerization עשויים להיות תלויים גם בגורמים תאיים אחרים. אם הגורמים הללו אינם ידועים, הניתוח הוא יותר קשה. בנוסף, כמה חלבונים שקשה לבטא ב E. coli כדי לטהר. לכן, שיטות אלה אינן הבחירה האופטימלית לנתח oligomerization חלבון בסביבת הסלולר. בנוסף, טכניקות אלה דורשים מכשירים יקרים אשר אינם זמינים.
ג'ל polyacrylamide ללא denaturing אלקטרופורזה (עמוד), כרומטוגרפיה הדרה גודל או crosslinking כימיים ואחריו סולפט dodecyl נתרן קונבנציונאלי (SDS) -PAGE הם כלי שימושי לאפיון היווצרות של oligomers מ lysates תא 2,19,20. שיטות אלו אינן מחייבות ציוד מיוחד והוא יכול להיות בקלות PErformed במעבדה סטנדרטית. אנחנו בתחילה העריכו פרוטוקולים cross-linking כימיים שונים שהובילו invariantly להצטברות הלא ספציפית ומשקעים של MxA. לכן, אנחנו הבאים נבדקים פרוטוקולי עמוד הלא denaturing. כדף הלא denaturing כולל את השימוש SDS, הגירה של חלבונים תלוי תשלום מולדתם. עמוד כחול-יליד משתמש G250 הכחול המבריק coomassie לטעון חלבונים עם תשלום הכולל שלילי, בדומה SDS, אבל לא לפגל החלבון 21. למרבה הצער, coomassie משקע כחול מבריק בנוכחות מלחי גבוה קטיונים divalent (למשל Mg 2+) כלולים לעתים קרובות מאגרים תמוגה. בהתאם המאגרים בשימוש, זה עלול להיות קשה לנתח את המדגם מבלי אופטימיזציה נוספת של צעדים, עלול להיות בעל השפעה על החלבון המורכב oligomeric.
כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט המבוסס על שיטה שפורסמה בעבר 22 כדי לקבוע oligomerization שלחלבון אנושי MxA נגזר lysates הסלולר באמצעות עמוד הלא denaturing.
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת הקביעה המהירה של מדינת oligomeric של חלבונים לידי ביטוי בתאי יונקים ידי עמוד הלא denaturing ואחריו ניתוח כתם מערבי. היתרון העיקרי של גישה זו היא כי המדינה oligomeric של חלבון נתון ניתן לקבוע מן lysates התא כולו ללא טיהור חלבון לפני. זו עשויה להיות חשובה…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
Milk powder | Migros/Switzerland | ||
Methanol | Millipore | 1.06009 | |
sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |