Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em> Drosophila melanogaster</em> Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light
Summary
Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.
Abstract
Het zenuwstelsel de opmerkelijke aanpassingsvermogen en reageren op verschillende stimuli. Dit neurale aanpassing wordt grotendeels bereikt door middel van plasticiteit in de synaptische niveau. De actieve zone (AZ) is het gebied aan het presynaptische membraan dat neurotransmitter afgifte bevordert en bestaat uit een dichte verzameling van scaffold proteïnen. AZS van Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptoren ondergaan moleculaire remodeling na langdurige blootstelling aan natuurlijk omgevingslicht. Dus het niveau van neuronale activiteit kan de moleculaire samenstelling van de AZ herschikken en bijdragen aan de regulering van de functionele output.
Uitgaande van de blootstelling aan licht set-up voorbereiding op de immunohistochemie, dit protocol beschrijft hoe om het nummer, de ruimtelijke verdeling, en de delokalisatie niveau van synaptische moleculen aan AZS in Drosophila fotoreceptoren te kwantificeren. Met behulp van beeldanalyse software, clusters van de GFP gefuseerde AZ component Bruchpilot werden geïdentificeerd voor elke R8 fotoreceptor (R8) axon terminal. Gedetecteerd Bruchpilot plekken werden automatisch toegewezen aan individuele R8 axonen. Om de verdeling van de spot frequentie langs de axon te berekenen, implementeerden we een op maat gemaakte software plugin. Elke axon's start-point en end-point werden met de hand bepaald en de positie van elk Bruchpilot spot werd geprojecteerd op de verbindingslijn tussen begin- en eindpunt. Naast het aantal Bruchpilot clusters, we gekwantificeerd ook de delokalisatie niveau van Bruchpilot-GFP binnen de clusters. Deze metingen weerspiegelen in detail de ruimtelijk opgeloste synaptische dynamiek in een enkel neuron onder verschillende milieu-omstandigheden op prikkels.
Introduction
De modulatie van synaptische functie draagt bij aan de opmerkelijke vermogen van het zenuwstelsel om exact te voldoen of aanpassen aan veranderende milieu stimuli. Aanpassing van de presynaptische afgifte vesicle kans is een manier van het controleren synaptische sterkte 1. Synaptische vesikel afgifte vindt plaats op de actieve zone (AZ), een gespecialiseerde gebied van het presynaptische membraan 2. AZ wordt gekenmerkt door een cassette van specifieke eiwitten 3, 4. Meeste eiwitten dragen aan AZ samenstel zijn sterk geconserveerd in nematoden, insecten en zoogdieren 5. Recente studies suggereren dat het niveau van neuronale activiteit regelt de moleculaire samenstelling van de AZ, die op zijn beurt bijdraagt aan de regeling van de functionele geven zowel in vitro als in vivo 6, 7,> 8. We eerder geconstateerd dat fotoreceptor AZS ondergaan moleculaire remodeling in Drosophila na langdurige blootstelling aan natuurlijke omgevingslicht 9. In deze toestand hebben we vastgesteld dat het aantal Bruchpilot (Brp) -positieve AZS werd gereduceerd in de fotoreceptor axonen.
De Brp / CAST / ELKS familie eiwitten zijn fundamentele bouwstenen van AZS in gewervelde en ongewervelde synapsen 10. In Drosophila brp mutanten, opgeroepen blaasje release onderdrukt 11, 12. De 17 C-eindstandige aminozuurresten van Brp essentieel zijn voor synaptische blaasjes clustering in de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) 13, 14. Deze studies toonden de centrale rol van dit molecuul in AZ inrichting en functie. Met een recent ontwikkelde genetische tool, Synaptic Tagging met Recombinatie (STAR), Brpkan worden waargenomen in vivo in specifieke celtypen, endogene expressieniveaus en één synaps resolutie 15. Dit instrument maakt het mogelijk om de endogene dynamiek van synapsen kwantitatief in het complex centrale zenuwstelsel evalueren.
Er zijn verschillende studies waaronder synaps kwantificering gebaseerd op gegevens verkregen van confocale microscopie geweest. Synaptische veranderingen werden geëvalueerd door meting van de lengte, het gebied, het volume, de dichtheid en het tellen op basis van geavanceerde softwaretoepassingen. Bijvoorbeeld, de freeware ImageJ biedt een kwantificering methode voor het totale synaptische gebied en synaptische dichtheid maatregelen op de Drosophila NMJ 16. Het aantal colocalization plaatsen van pre-en postsynaptische markers zijn gekwantificeerd met behulp van de plugin "Puncta Analyzer" beschikbaar op de ImageJ software platform 17. Als alternatief, een multi-paradigm numerieke computeromgeving gebaseerde programma Synapse Detector (synd), automatisch traceren dendrieten van neuronen gelabeld met een fluorescerende marker, en kwantificeert de synaptische eiwitniveaus als functie van de afstand van het cellichaam 18. De software Synaptic Puncta Analyse (SynPAnal), is ontworpen voor de snelle analyse van 2D-beelden van neuronen verkregen uit of confocale fluorescentiemicroscopie. De primaire functie van deze software is de automatische en snelle kwantificering van dichtheid en intensiteit van eiwitten puncta 19. Recent is een automatisch leren die synaps algoritme gegenereerd voor kwantificering van synaptische aantal 3D 20, gebruik te maken van de 3D-visualisatie Assisted Analysis (Vaa3D) software 21.
image commerciële analyse software zijn ook krachtige tools voor het synaptische kwantificeringen. Bijvoorbeeld, de fluorescentiegelabelde neurotransmitter receptoren of presynaptische AZ component zijn gekwantificeerd in drie dimensies met één synaps resolutie in C. elegans 22 of Drosophila olfactorisch systeem 23, 24, waardoor honderden synapsen snel te karakteriseren binnen een enkel monster.
Hier presenteren we een methode een aangepaste beeldanalyse software plug-in uitgevoerd in een multi-paradigma numerieke computeromgeving die toestaat om semi-automatisch verschillende aspecten van AZS, met inbegrip van hun aantal, de locatie en het niveau van verrijking van moleculaire componenten te analyseren het AZ. Aldus is deze complexe analyse konden we de dynamiek van synaptische bestanddelen in axon terminals onder verschillende omgevingsomstandigheden evalueren. Wij onderzochten het effect van blootstelling aan licht op de output synapsen van de volwassen vlieg fotoreceptoren. De procedure wordt uitgevoerd in drie stappen: 1)voorbereiding op blootstelling aan licht, 2) dissectie, immunohistochemie en confocale beeldvorming, en 3) beeldanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we laten zien hoe de lichtomstandigheden te bereiden om vliegen bloot te stellen aan een gelijke lichtintensiteit. We gekwantificeerde niet alleen een aantal synaptische marker puncta maar kan ook ruimtelijk oplossen van de dichtheid van synapsen langs axonen en meet de delokalisatie niveau van het markereiwit in cytoplasmatische gebieden. Deze drie evaluaties kunnen we de details van de synaptische dynamiek enkel neuron niveau in verschillende milieu-omstandigheden te evalueren. Ons protocol kan w…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor T. Stürner voor nuttige correcties, discussies en commentaar op het manuscript; SL Zipursky voor het verstrekken van vliegen voorraden; M Schölling voor het uitvoeren van beeldverwerking. Een deel van de beeldanalyse werd uitgevoerd bij A. Kakita het lab. Dit werk werd ondersteund door Alexander von Humboldt Foundation en JSPS Fellowships voor onderzoek in het buitenland (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In- Steun voor start-up (24800024), inzake innovatieve Areas (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE basisfinanciering (GT) en DZNE Light Microscopy Facility (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
