Analyse Synaptische Modulation von<em> Drosophila melanogaster</em> Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht
Summary
Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.
Abstract
Das Nervensystem hat die bemerkenswerte Fähigkeit, auf verschiedene Reize anzupassen und zu reagieren. Diese neuronale Anpassung wird weitgehend durch Plastizität bei der synaptischen Ebene erreicht. Die aktive Zone (AZ) ist der Bereich an der präsynaptischen Membran, die die Freisetzung von Neurotransmittern vermittelt und ist von einer dichten Ansammlung von Gerüstproteine bestehen. AZs von Drosophila melanogaster (Drosophila) Photorezeptoren unterziehen molekularen Remodeling nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht. Somit ist die Höhe der neuronalen Aktivität kann die molekulare Zusammensetzung der AZ neu anordnen und die Regulierung des Funktionsausgang beitragen.
Ausgehend von der Belichtung Set-up Vorbereitung auf die Immunhistochemie, Details dieses Protokoll , wie die Anzahl zu quantifizieren, um die räumliche Verteilung und die Delokalisierung Ebene synaptischer Moleküle an AZs in Drosophila Photorezeptoren. Mit Bildanalyse software, Cluster des GFP-fusionierten AZ Komponente Bruchpilot wurden für jede R8 Photorezeptor (R8) Axonterminal identifiziert. Erkannt Bruchpilot Spots wurden auf einzelne R8 Axone automatisch zugewiesen. Um die Verteilung der Frequenzkanal entlang des Axons zu berechnen, führten wir eine maßgeschneiderte Software-Plugin. Jedes Axon Startpunkt und Endpunkt wurden manuell definiert und die Position jedes Bruchpilot Stelle wurde auf der Verbindungslinie zwischen Start- und Endpunkt projiziert. Neben der Anzahl der Bruchpilot Cluster, quantifiziert wir auch die Delokalisierung Niveau der Bruchpilot-GFP innerhalb der Cluster. Diese Messungen beziehen sich im einzelnen ortsaufgelösten synaptic Dynamik in einem einzigen Neuron unter verschiedenen Umgebungsbedingungen auf Reize.
Introduction
Die Modulation der synaptischen Funktion trägt zu der bemerkenswerten Fähigkeit des Nervensystems genau zu reagieren oder auf sich ändernde Umweltstimuli anpassen. Die präsynaptischen Vesikelfreisetzung Wahrscheinlichkeit Einstellen ist eine Möglichkeit , 1 synaptischen Stärke zu steuern. Synaptische Vesikel – Freisetzung erfolgt an der aktiven Zone (AZ), einem spezialisierten Bereich der präsynaptischen Membran 2. Die AZ wird durch eine Kassette von spezifischen Proteinen charakterisiert 3, 4. Die meisten Proteine zu AZ Montage beitragen , werden in Nematoden, Insekten und Säugetieren 5 hoch konserviert. Neuere Studien legen nahe , dass das Niveau von neuronaler Aktivität der molekularen Zusammensetzung des AZ reguliert, das wiederum trägt zur Regelung der Funktionsausgang sowohl in vitro als auch in vivo 6, 7,> 8. Wir fanden vorher , dass Photorezeptor AZs molekulare Umbau in Drosophila unterzogen werden nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht 9. In diesem Zustand wurde beobachtet, dass die Anzahl der Bruchpilot (BRP) -positiven AZs in dem Photorezeptor Axone reduziert wurde.
Die Brp / CAST / ELKS Familie Proteine sind Grundbausteine von AZs in Wirbeltieren und wirbellosen Synapsen 10. Bei Drosophila brp Mutanten, evozierte Vesikelfreisetzung 11 unterdrückt wird, 12. Die 17 C-terminalen Aminosäurereste von Brp sind für synaptic vesicle clustering an der Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) 13, 14. Diese Studien zeigten, die zentrale Rolle dieses Moleküls in AZ Organisation und Funktion. Mit einem neu entwickelten genetischen Werkzeug, synaptic tagging mit Rekombinations (Stern), Brpkann in vivo in spezifische Zelltypen, bei endogenen Expressionsniveaus und bei einer einzelnen Synapse Auflösung 15 beobachtet werden. Dieses Werkzeug ermöglicht es, die endogene Dynamik der Synapsen quantitativ in dem Komplex des zentralen Nervensystems zu bewerten.
Es wurden mehrere Studien Quantifizierungen einschließlich Synapsen basierend auf Daten aus der konfokalen Mikroskopie erhalten. Synaptische Veränderungen wurden durch Messen der Länge, die Fläche, das Volumen, die Dichte und das Zählen der Anzahl basierend auf hoch entwickelten Software-Anwendungen bewertet. Zum Beispiel stellt die Freeware ImageJ eine Quantifizierungsmethode für die gesamte synaptischen Bereich und Synapsendichte Maßnahmen an der Drosophila NMJ 16. Die Anzahl der Kolokalisation Websites von Pre – und postsynaptischen Markern wurden 17 mit dem Plugin "Puncta Analyzer" auf der ImageJ Software – Plattform quantifiziert. Alternativ kann ein Multi-Paradigm numerischen Rechenumgebung basiertes Programm, Synapse Detector (SYND) können automatisch mit einem fluoreszierenden Marker markiert Dendriten von Neuronen Spuren und quantifiziert dann die synaptischen Proteinmengen als Funktion des Abstands von dem Zellenkörper 18. Die Software Synaptische Puncta Analysis (SynPAnal), hat sich für die schnelle Analyse von 2D-Bildern von Neuronen erworben von konfokalen oder Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Die primäre Funktion dieser Software ist die automatische und schnelle Quantifizierung von Dichte und Intensität der Protein puncta 19. Vor kurzem wurde eine automatische lernbasierte Synapse Erkennungsalgorithmus wurde für die Quantifizierung der synaptischen Zahl in 3D 20, erzeugt wurde 21 die Vorteile der 3D – Visualisierung-Assisted Analysis (Vaa3D) Software nehmen.
Kommerzielle Bildanalyse-Software sind auch leistungsfähige Werkzeuge für die synaptische Quantifizierungen. Zum Beispiel kann die fluoreszenzmarkiertem Neurotransmitter – Rezeptoren oder eine präsynaptische AZ Komponente in drei Dimensionen mit Einzelsiebzug Synapse Auflösung in C. elegans 22 oder der Drosophila olfaktorische System 23, 24, so dass Hunderte von Synapsen zu schnell charakterisiert innerhalb einer einzigen Probe quantifiziert.
Hier präsentieren wir eine Methode, durch eine maßgeschneiderte Bildanalyse-Software-Plug-in in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung implementiert, die halbautomatisch mehrere Aspekte der AZs analysieren können, einschließlich deren Anzahl, Verteilung und dem Grad der Anreicherung von molekularen Komponenten zu der AZ. Somit ist diese komplexe Analyse erlaubt uns, die Dynamik der synaptischen Komponenten in Axonterminalen unter verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten. Wir untersuchten die Wirkung von Licht-Exposition auf den Ausgangs Synapsen der erwachsenen Fliege Photorezeptoren. Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1)Vorbereitung zur Belichtung, 2) Dissektion, Immunhistochemie und konfokale Bildgebung und 3) Bildanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir gezeigt, wie die Lichtverhältnisse vorzubereiten Fliegen auf eine gleiche Lichtintensität zu belichten. Wir quantifiziert nicht nur die Anzahl der synaptischen puncta Marker könnte aber auch räumlich die Dichte von Synapsen entlang Axone lösen und die Delokalisierung Ebene des Markerproteins in zytoplasmatischen Bereichen zu messen. Diese drei Beurteilungen ermöglichen es uns, die Details der synaptischen Dynamik bei einzelnen Neurons Ebene in verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken T. Stürner für hilfreiche Korrekturen, Diskussionen und Kommentare zum Manuskript; SL Zipursky fly Aktien zu liefern; M Schölling zum Durchführen einer Bildverarbeitung. Ein Teil der Bildanalyse wurde bei A. Kakita Labor durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung und JSPS-Stipendien für Forschung unterstützt im Ausland (AS), JSPS-Stipendiaten (SH-S.), Grant-In-Hilfe für die Inbetriebnahme (24800024), auf innovative Bereiche (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE Kernfinanzierung (GT) und DZNE Einrichtung Lichtmikroskopie (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
