Анализ Synaptic модуляция<em> Дрозофилы</em> Фоторецепторы после экспозиции продолжительному воздействию света
Summary
Здесь мы покажем , как определить число и пространственное распределение синаптических активных зон в дрозофилы фоторецепторов, выделенный с генетически закодированного молекулярным маркером, и их модуляция после длительного воздействия света.
Abstract
Нервная система обладает замечательной способностью приспосабливаться и реагировать на различные стимулы. Эта нейронная регулировка во многом достигается за счет пластичности на уровне синапса. Активная зона (АЗ) является областью на пресинаптической мембране, который опосредует высвобождение нейромедиаторов и состоит из плотной коллекции каркасных белков. AZS дрозофилы (Drosophila) фоторецепторы подвергаются молекулярной ремоделирования после продолжительного воздействия естественного окружающего света. Таким образом, уровень активности нейронов может перестраивать молекулярную состав AZ и внести свой вклад в регулирование функционального выхода.
Начиная с подготовки экспозиции света установленный вплоть до иммуногистохимии, этот протокол подробно описано , как определить число, пространственное распределение и уровень делокализации синаптических молекул на AZS в Drosophila фоторецепторов. С помощью анализа изображений SOFtware, были идентифицированы кластеры GFP-плавленого AZ компонент Bruchpilot для каждого R8 фоторецепторов (R8) аксона. Обнаруженные пятна Bruchpilot были автоматически присвоены отдельным аксонов R8. Для того, чтобы вычислить распределение частоты пятна вдоль аксона, мы реализовали плагин заказного программного обеспечения. старт-очку AXON и конечной точки были вручную определены и положение каждого пятна Bruchpilot проецировалось на соединительной линии между начальной и конечной точкой. Кроме того, количество кластеров Bruchpilot, мы также количественно уровень делокализации Bruchpilot-GFP внутри кластеров. Эти измерения отражают в деталях пространственно разрешенная динамика синаптические в одном нейроне при различных условиях окружающей среды на раздражители.
Introduction
Модуляция синаптической функции способствует замечательной способности нервной системы, чтобы точно реагировать или адаптации к изменению внешних стимулов. Регулировка пресинаптического вероятность выхода пузырек является одним из способов управления синаптическую силу 1. Synaptic релиз везикулы происходит в активной зоне (АЗ), специализированной области пресинаптической мембраны 2. АЗ характеризуется кассетой специфических белков 3, 4. Большинство белков , способствующих сборке AZ высоко консервативны у нематод, насекомых и млекопитающих 5. Недавние исследования показали, что уровень активности нейронов регулирует молекулярный состав АЗ, что в свою очередь способствует регуляции функционального выхода в пробирке и в естественных условиях 6, 7,> 8. Ранее мы обнаружили , что фоторецепторов AZS подвергаются молекулярной ремоделирования у дрозофилы после продолжительного воздействия естественного окружающего света 9. В этом состоянии, мы обнаружили, что количество Bruchpilot (BRP) -положительным AZS была снижена в фоторецепторных аксонов.
БРП / CAST / семьи ELKS белки являются основными строительными блоками AZS в позвоночных и беспозвоночных синапсах 10. В BRP мутантов Drosophila, вызванных релиз везикулы подавляется 11, 12. 17 С-концевые аминокислотные остатки BRP имеют важное значение для синаптической везикулы кластеризацию в Drosophila нервно – мышечном соединении (НМС) , 13, 14. Эти исследования показали центральную роль этой молекулы в организации и функции AZ. С помощью недавно разработанного генетического инструмента, Synaptic мечения с рекомбинацией (СтАР), BRPможно наблюдать в естественных условиях в конкретных типах клеток, на эндогенные уровни экспрессии и в одном разрешении синапса 15. Этот инструмент делает возможным оценить эндогенные динамику синапсов количественно в сложной центральной нервной системы.
Там было несколько исследований, в том числе синапсов количественными на основе данных, полученных из конфокальной микроскопии. Синаптические изменения были оценены путем измерения длины, площади, объема, плотности и подсчета числа, основанные на сложных программных приложений. Например, бесплатное программное обеспечение ImageJ предоставляет метод для количественного определения общей синаптической области и меры синаптической плотности в Drosophila NMJ 16. Число колокализации участков до и постсинаптических маркеров были количественно с помощью плагина "Puncta Analyzer" , доступных на ImageJ программной платформы 17. С другой стороны, несколько парПрограмма на основе adigm числовая вычислительная среда, синапс детектор (Synd), может автоматически отслеживать дендритов нейронов , меченных флуоресцентным маркером, а затем квантифицирует синаптические уровни белка в зависимости от расстояния от тела 18 клеток. Программное обеспечение Synaptic Puncta анализ (SynPAnal), был разработан для проведения экспресс-анализа 2D-изображений нейронов, полученных из конфокальной или флуоресцентной микроскопии. Основная функция этого программного обеспечения является автоматическое и быстрое количественное определение плотности и интенсивности белка Puncta 19. В последнее время , автоматический алгоритм обнаружения синапс обучения на основе был создан для количественного определения синаптической числа в 3D 20, воспользовавшись 3D визуализации-Assisted анализа (Vaa3D) программного обеспечения 21.
Программное обеспечение для анализа коммерческих изображений также являются мощными инструментами для синаптических количественными. Например, флуоресцентномеченые рецепторы нейротрансмиттеров или пресинаптический компонент АЗ измерялись количественно в трех измерениях с разрешением одного синапса в C. Элеганс 22 или обоняния дрозофила 23, 24, позволяя сотни синапсов, быстро охарактеризовать в пределах одного образца.
Здесь мы представляем метод с помощью специального программного обеспечения для анализа изображений плагин реализован в несколько парадигм численного вычислительной среды, которая позволяет анализировать полуавтоматически несколько аспектов AZS, в том числе их количество, распределение и уровень обогащения молекулярных компонентов в нажатия кнопки АЗ. Таким образом, этот комплексный анализ позволил нам оценить динамику синаптических компонентов в аксонов терминалов в различных экологических условиях. Мы исследовали влияние освещенности на выходных синапсах взрослых фоторецепторов мух. Процедура выполняется в три этапа: 1)подготовка к освещённости, 2) рассечение, иммуногистохимии и конфокальной микроскопии, и 3) анализа изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данном исследовании мы показали, как приготовить легкие условия, чтобы выставить мух равной интенсивности света. Мы не только количественно число синаптических маркеров Puncta, но и может пространственно решить плотность синапсов вдоль аксонов и измерить уровень делокализации маркер?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Т. Sturner за полезные корректировки, обсуждения и замечания по рукописи; SL Zipursky для обеспечения запасов мух; M Schölling для выполнения обработки изображений. Часть анализа изображений была выполнена в лаборатории А. Kakita в. Эта работа была поддержана Александра фон Гумбольдта и стипендий JSPS по научным исследованиям за рубежом (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Грант-In- помощи для запуска (24800024), по инновационным районам (25110713), Мотида, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE основное финансирование (GT) и DZNE световой микроскопии Facility (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
