의 시냅틱 변조 분석<em> 노랑 초파리</em> 장시간 빛에 노출 후 광수
Summary
여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.
Abstract
신경계는 적응하고 다양한 자극에 반응하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 이 신경 조정은 크게 시냅스 수준에서 소성을 통해 달성된다. 활성 영역 (AZ)는 신경 전달 물질 방출을 매개과 골격 단백질의 조밀 한 컬렉션으로 구성되어 시냅스 막에서의 영역이다. 노랑 초파리의 AZS은 (초파리) 광 수용체 자연 주변 광에 장시간 노출 된 후 분자 리모델링을 받다. 따라서, 신경 세포 활성도의 레벨은 AZ의 분자 성분을 재 배열하여 출력 기능의 조절에 기여할 수있다.
면역 조직 화학에 빛을 노출 설정 준비에서 시작,이 프로토콜은 수, 공간적 분포 및 초파리의 광 수용체에 AZS에서 시냅스 분자의 비편 재화 수준을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이미지 분석 SOF 사용tware의 GFP 융합 AZ 구성 요소 Bruchpilot의 클러스터는 각 R8의 광 수용체 (R8) 축삭 터미널 확인되었다. 감지 Bruchpilot 명소가 자동으로 개별 R8의 축삭에 할당되었다. 축삭을 따라 자리 주파수의 분포를 계산하기 위해, 우리는 사용자 정의 소프트웨어 플러그인을 구현했습니다. 각 축삭의 시작 지점과 끝 지점을 수동으로 정의 된 각 Bruchpilot 지점의 위치는 시작과 끝 지점 사이의 연결 라인에 투영되었다. Bruchpilot 클러스터의 수 외에, 우리는 또한 클러스터 내의 Bruchpilot-GFP의 비편 재화 수준을 정량화. 이러한 측정은 서로 다른 환경 조건 하에서 단일 신경 세포의 공간적 해결 시냅스 역학 자극에 구체적으로 반영합니다.
Introduction
시냅스 기능의 변조를 정확하게 대응 자극이나 환경 변화에 적응할 수있는 신경계의 놀라운 능력에 기여한다. 시냅스 소포 방출 확률을 조정 한 시냅스 강도를 제어하는 하나의 방법이다. 시냅스 소포 릴리스는 활성 영역 (AZ), 시냅스 막 2의 전문 영역에서 발생한다. AZ는 특정 단백질 (3)의 카세트, (4)에 의해 특징입니다. AZ 어셈블리에 기여하는 대부분의 단백질은 매우 선충, 곤충, 포유류 (5)에 보존되어있다. 최근의 연구는 신경 활동의 레벨이 차례로 모두 시험 관내 및 생체 내 (6, 7)의 출력 기능의 조절에 기여 AZ, 분자 조성을 조절하는 것을 제안> 8. 우리는 이전에 광 수용체 AZS 자연 환경 광 (9)에 장시간 노출 된 후 초파리의 분자 리모델링을 겪는 것으로 나타났습니다. 이 상태에서는 Bruchpilot (BRP) 양성 AZS 수가 감광체 축삭 감소되었음을 관찰 하였다.
BRP / CAST / ELKS 가족 단백질은 척추 동물과 무척추 동물의 시냅스 (10) AZS의 기본 빌딩 블록입니다. 초파리 BRP 돌연변이 체에서 소포 자료, 12 (11)을 억제 유발. BRP 17의 C 말단 아미노산 잔기는 초파리 신경근 접합 (NMJ) (13) (14)에 연접 소포 클러스터링 필수적이다. 이 연구는 AZ의 조직과 기능에서이 분자의 중심 역할을 보여 주었다. 재조합 (STAR), BRP와 최근에 개발 된 유전 도구, 시냅틱 태그와내인성 발현 수준 번의 시냅스 해상도 15, 특정 유형의 세포에서 생체 내에서 관찰 할 수있다. 이 도구는 가능한 정량적 복소 중추 신경계의 시냅스 내인성 역학을 평가한다.
공 초점 현미경에서 얻은 정보에 기초하고 시냅스의 정량화를 포함한 여러 연구가 있었다. 시냅스 변화는 길이, 면적, 체적 밀도를 측정하고 정교한 소프트웨어 애플리케이션에 기초하여 상기 수를 계수하여 평가 하였다. 예를 들어, 프리웨어 ImageJ에 총 시냅스 영역 및 초파리 NMJ 16 시냅스 농도를 측정하는 정량 방법을 제공한다. 사전 및 시냅스 마커의 colocalization을 사이트의 수는 ImageJ에 소프트웨어 플랫폼 (17)에서 사용할 수있는 플러그인 "puncta의 분석"을 사용하여 정량화하고있다. 대안 적으로, 다중 파adigm 수치 컴퓨팅 환경을 기반으로 프로그램 시냅스 검출기 (신디케이트)는 자동 형광 마커로 표지 된 신경 돌기를 추적 한 다음, 전지 본체 (18)로부터의 거리의 함수로서 시냅스 단백질 수준을 정량화 할 수있다. 소프트웨어 시냅스 puncta의 분석 (SynPAnal)은, 공 초점 형광 현미경으로부터 취득 뉴런의 2 차원 영상의 신속한 분석을 위해 설계되었다. 이 소프트웨어의 주요 기능은 단백질 puncta의 (19)의 밀도 및 강도의 자동적이고 빠르게 정량화이다. 최근, 자동 학습 기반 시냅스 검출 알고리즘은 3 차원 시각화 이용한 분석 (Vaa3D) 소프트웨어 (21)을 활용 3D 20 시냅스 수 정량에 대해 생성되었다.
상용 이미지 분석 소프트웨어는 또한 시냅스 정량화를위한 강력한 도구입니다. 예를 들어, 형광표지 된 신경 전달 물질 수용체 또는 시냅스 AZ 구성 요소는 C에서 단일 시냅스 해상도 22 엘레 간스 또는 시냅스의 수백을 허용 초파리 후각 시스템 23, 24, 빠르게 하나의 샘플에서 특징으로하는 세 차원으로 정량화되고있다.
여기서는 사용자 정의 이미지 분석 소프트웨어에 의한 방법을 제시 플러그 그들의 수, 분포 및 분자량 성분의 농축 수준으로 포함 AZS의 반자동 여러 양상을 분석 할 수있는 멀티 패러다임 수치 컴퓨팅 환경에서 구현 AZ. 따라서,이 복잡한 분석은 서로 다른 환경 조건 하에서 축삭 터미널에서 시냅스 구성 요소의 역학을 평가하기 위해 우리를 허용했다. 우리는 성인 플라이 광 수용체의 출력 시냅스에 빛 노출의 효과를 조사 하였다. 프로 시저가 세 단계로 수행된다 : 1)노광, 2) 해부, 면역 조직 화학 및 공 초점 이미징, 3) 이미지 분석을위한 준비.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 동일한 빛의 세기에 파리를 노출하는 조명 조건을 준비하는 방법을 보여 주었다. 우리는 단지 시냅스 마커 puncta의 수를 정량 아니라 축삭을 따라 공간적으로 시냅스의 밀도를 해결 세포질 영역에서 마커 단백질의 비편 재화 수준을 측정 할 수있다. 이 세 가지 평가는 우리가 다른 환경 조건에서 단일 신경 세포 수준에서 시냅스 역학의 세부 사항을 평가 할 수 있습니다. 우리의 프?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 도움이 수정, 토론 및 의견 T. Stürner에 감사하고 있습니다; 플라이 주식을 제공하는 SL Zipursky; 화상 처리를 행하는 M Schölling. 이미지 분석의 일부는 A. Kakita의 실험실에서 수행되었다. 이 작품은, 혁신적인 분야에 시동을위한 알렉산더 폰 훔볼트 재단과 JSPS 동호회 해외 연구 (AS), JSPS 휄로우 (SH-S.), 그랜트-IN- 원조 (24800024), (25110713), 모치다에 의해 지원되었다 다케다, 이나모리, 다이 이치 산쿄, 도레이 재단 (TS), DZNE 핵심 자금 (GT)과 DZNE 광학 현미경 시설 (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
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