Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.
Abstract
Bildgebung lebender Zellen wird verwendet , um gleichzeitig Zeitrafferbilder von Angiotensin Typ 1a - Rezeptoren erfassen (AT 1a R) und intrazelluläre Kompartimente in transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK - Zellen) nach Stimulation mit Angiotensin II (Ang II). HEK - Zellen werden transient transfiziert mit Plasmid - DNA AT 1a R enthält , mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) markiert. Lysosomen sind mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff identifiziert. Live-cell Bilder werden auf einem Laser-Scanning-Mikroskop nach dem konfokalen Ang II Stimulation erfasst und analysiert durch Software in drei Dimensionen (3D, Voxel) über die Zeit. Bildgebung lebender Zellen ermöglicht Untersuchungen zur Rezeptor-und vermeidet verwechselt mit Fixierung verbunden sind, und insbesondere der Verlust oder artifizielle Verschiebung von EGFP-markierten Membranrezeptoren. Somit ist, wie einzelne Zellen über die Zeit verfolgt werden, kann die subzelluläre Lokalisierung von Rezeptoren abgebildet und gemessen werden. Die Bilder müssen sufficientl erworben werdeny schnell schnellen Vesikel Bewegung zu erfassen. Doch bei schnelleren Belichtungsgeschwindigkeit wird die Anzahl der Photonen gesammelt reduziert. Kompromisse müssen auch bei der Auswahl der Abbildungsparameter wie Voxelgröße um Abbildungs erfolgen Geschwindigkeit zu gewinnen. Bedeutende Anwendungen von Live-Cell-Imaging sind Proteintransport zu untersuchen, Migration, Proliferation, Zellzyklus, Apoptose, Autophagie und Protein-Protein-Wechselwirkung und Dynamik, um nur einige zu nennen.
Introduction
Das Gesamtziel ist mit einem Rezeptor-Agonisten mit spezifischen subzellulären Organellen nach der Behandlung quantitative Nachweis in Zeit und Raum von Rezeptor Kolokalisation zu erhalten. Hier ist also das unmittelbare Ziel ist Zeitraffer konfokale Bilder von Lysosomen und ein Transmembranrezeptor in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) nach der Transfektion und anschließend zusammenstellen und analysieren, um die Bilddaten in 3D zu erfassen, um quantitativ die Lieferung von Rezeptor messen Lysosomen. Die Untersuchung der gleichzeitigen Handel eines Transmembranrezeptor mit Lysosomen oder anderen Organellen während der Endozytose, wenn sie von Rezeptor-Ligand aktiviert kann helfen, festzustellen, wie die Transmembranrezeptor unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen reguliert wird.
AT 1a R wird angenommen , daß in Modellzellen - Systeme mit Ang II in Lysosomen nach der Behandlung abgebaut zu werden, in erster Linie HEK293 1 , obwohl die Mehrheit der receptors sind in multivesikulären Recycling Endosomen zur späteren Rückführung in die Plasmamembran , während die Masse des Liganden Ang II hauptsächlich lokalisiert, im Lysosom abgebaut wird 2, 3, 4, 5. In jüngerer Zeit, Li et al. mit Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) und Fluorescence Lifetime Imaging - Mikroskopie (FLIM) Techniken gezeigt , dass AT 1a R kolokalisiert (auf ~ 10 nm - Skala) mit LAMP1, Protein eine lysosomale Membran darauf hindeutet , dass zumindest ein Teil des Rezeptors gerichtet ist und abgebaut von Lysosomen 6. Diese Autoren stellten fest , dass der lysosomalen Inhibitor Chloroquin AT 1a R-LAMP1 Assoziation blockiert , die mit früheren Berichten konsistent ist darauf hindeutet , dass eine Wirkung von Chloroquin ist die Fusion von späten Endosomen oder Autophagosomen mit Lysosomen zu blockieren. Andere indirekte Ansätze AT 1a R l zu bestimmen ,ocalization in Lysosomen wurden verwendet Bafilomycin, einen lysosomalen Inhibitor AT 1a R Anwesenheit in Lysosomen 3, 4, 5, 6, 7, 8 zu schließen.
Bildgebung lebender Zellen vermeidet mögliche Auswirkungen der Fixierung auf das Zellvolumen und Verlust / Dimmen / Umverteilung von GFP-chimären Rezeptors. Frühere Studien haben auf fixierten Zellen verlassen Kolokalisation oder Co-Auftreten des Rezeptors mit Lysosomen oder unter Verwendung von lebenden Zellen mit Rezeptorbindungs Surrogate wie β-Arrestin - 1, 2, 3, 4, 5, 6 markiert zu bestimmen. Abbildung lebender Zellen von anderen GPCRs mit Kreiselscheibenapplikators konfokalen oder Laserpunktabtastung confOcal Mikroskope mit GaAsP oder HYD Detektoren aktiviert Ermittler die Internalisierung und den Handel von Rezeptoren in einzelnen Zellen in z-Stacks bei 30 s Intervallen 9, 10 abgebildet zu beobachten. Jedoch selbst wenn Lebendzell z-Stapel schnell gesammelt werden, die Analyse nur innerhalb jedes Stapels nach der Auswahl einer einzigen Ebene auftritt, dh in 2D 10. Während dies für die Untersuchung der internalisierten GPCR oder Tyrosin - Kinase - Rezeptor in Frage ausreichend sein, akkumuliert die AT 1a Rs in Vesikeln , die Größe und die Position mit der Zeit ändern und somit von Natur aus schwieriger zu ausreichend zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung eines repräsentativen Einzelschicht abzutasten. Um gründlich die Strecke von der AT 1a R durch die Zelle markiert bestimmen und jede Subpopulation von Vesikeln in Größe und Position unterschiedlich zu erkennen, haben wir ein Verfahren zur 3D - Bildgebung und 3D - Analyse entwickelt , um diese Änderungen zu verfolgen und zu sein in Verbindung mit der Kennzeichnung von verschiedenen intrazellulären Kompartimenten, wie beispielsweise Lysosomen verwendet.
Die Ermittler können dieses Protokoll für Live-Cell - Imaging verwenden , um direkt die Bewegung der AT 1a R in die Zelle und ihre Übertragung auf subzellulärer Kompartimente folgende Ang II Stimulation zu visualisieren. Subzellulärer Kompartimente sind mit fluoreszierenden Protein-Chimären oder anderen fluoreszierenden Markern markiert. Dieses Protokoll kann auch als ein erster Ansatz verwendet werden Rezeptoren in subzellulären Organellen mit einer Auflösung von mindestens 200 nm, um zu lokalisieren, im Vergleich zu Wildtyp-Rezeptoren mutiert zu vergleichen oder Veränderungen nach pharmakologischen Behandlungen zu erkennen. Die Technik ist zugänglich, da es für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet auf jedem konfokalen Mikroskop durchgeführt werden kann. Die relative Leichtigkeit dieses Ansatzes im Gegensatz zu ihr Fachwissen und Ausrüstung zur Durchführung von FRET / FLIM / BRET Techniken benötigt , die 6 molekularen Wechselwirkungen erkennen,"xref"> 11. Diese Messungen definieren Protein-Protein-Wechselwirkungen mit hoher Auflösung (~ 10 nm) und Lokalisierung innerhalb subzellulärer Organellen geschlossen wird. Diese fortgeschrittenen Techniken werden verwendet , um zu verfolgen und weiter zu definieren molekularen Wechselwirkungen von Interesse, anstatt die Passage von Rezeptoren durch subzellulärer Kompartimente, und sie direkt von Protein-Protein - Interaktionen zu bestimmten Zeiten und Orte innerhalb der Zelle 11 zu demonstrieren. FLIM, eine FRET-Technik unabhängig von Akzeptorkonzentration, wird am häufigsten auf festen Proben durchgeführt, da die Bildaufnahme ist langsamer. Im Gegensatz dazu stellt Verhältnis FRET schnelle Bildgebung und hoher Auflösung Kolokalisation von interagierenden Proteinen. Der Nachteil Verhältnis FRET ist , dass Bildgebung Weitfeld- Epi-Fluoreszenz nutzt Bildgebungsgeschwindigkeit zu gewinnen und die gesamte Zelle zu schließen, was zu einer geringeren Auflösung und Kontrast von Organellen 12. Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) ist ein weitererfortgeschrittene Technik, die GPCRs angewendet wurde 11 die Erfassung molekularer Nähe über der Zeit zu messen. Bei dieser Technik ist ein Protein Fluorophor molekular geteilt und jede Hälfte auf einen von zwei Proteine in Frage verknüpft. Wenn die beiden Proteine von Interesse binden einander die Teile des chimären Tag wieder zusammenbauen Fluoreszenz und die erhöhte Fluoreszenz über die Zeit quantifiziert zu erwerben.
Hier präsentieren wir eine einfache Technik für Live-Cell - Imaging in Verbindung mit Bild Quantifizierung Handel von AT 1a R zu studieren in der Zelle auf Ang II Stimulation und der möglichen Änderung der Lieferung von internalisierten AT 1a R zu Lysosomen folgende Ang II - Stimulation. Die ultimative Anwendung für diese Technik ist es, Unterschiede in der Membranhandel Vergleich Wildtyp zu charakterisieren und mutierten Rezeptoren. Diese Unterschiede werden dazu beitragen , den Mechanismus (n) , die Auswirkungen physiologischen Aktivitäten von AT 1a R leadi zu identifizierenng der Regulierung des Blutdrucks.
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Protocol
Tag eins
1. Zell Seeding
- Bereiten vollständige Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM). 50 ml fötalem Rinderserum, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml L-Glutamin zu 450 ml DMEM 500 ml komplettem DMEM mit fötalem Rinderserum (10%), Penicillin / Streptomycin (1%) ergänzt, um und L-Glutamin (1%).
- Seed menschliche embryonale Niere (HEK-Zellen), Passage-Nummer 6-11 bei 50.000 / Vertiefung in einem 8 gut chambered Abdeckglas System in komplettem DMEM.
- Aufrechterhaltung der gekammert slide bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 24 h.
Tag zwei
2. Liposome Transfection
- Machen Frisch AT 1a R-GFP - Plasmid und Liposom - Lösungen unter Verwendung von sterilen Bedingungen mit einem Biosicherheitsstufe 2 Schrank.
- Verdünnen Sie 2 ul von Plasmid-DNA bei 900 ng / ul Stammlösung in 178 & mgr; l reduziert Serum Medien ein Konzentrat zu erreichenIonen von Plasmid-DNA von etwa 10 ng / & mgr; l.
- Verdünnen Sie 4,5 ul Liposomenstammlösung in 175,5 ul reduziert Serum Medien eine Verdünnung von 1:40 der Aktie zu schaffen.
- Fügen Sie die Liposomen-Lösung für das Plasmid-Lösung und mischen durch eine 1 ml-Pipette mit pipettiert nach oben und unten 20-mal die Transfektion Lösung zu mischen.
- Inkubieren der Mischung für 30 min bei Raumtemperatur (25-27 ° C).
- Während diese Mischung inkubiert wird, entfernen das Medium langsam mit einer 1 ml Pipette und langsam 400 ul 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen, die auf 37 ° C vorgewärmt ist.
- Sie vorsichtig die PBS mit 200 & mgr; l / Vertiefung reduziert Serum Medien vorgewärmt auf 37 ° C zu entfernen und zu ersetzen.
HINWEIS: bei allen Schritten Vorsicht beim Waschen der Zellen Ablösung von Zellen aus dem Deckglas aufgrund durch Pipettieren induzierte Scherbeanspruchung zu vermeiden. - Pflegen der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 30 min.
- Sobald derInkubationszeit beendet ist, fügen 80 ul Transfektionsgemisch in jede Vertiefung und Inkubieren der Zellen für 4,0-4,5 h , aber nicht mehr als 5 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
- Nach der Transfektion Inkubationszeit abgeschlossen ist, entfernen Sie langsam den Medien aus den Kammern eine 1 ml - Pipette verwenden und vorsichtig mit 300 & mgr; l / Vertiefung von kompletten DMEM und inkubieren Zellen für 24 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 ersetzen .
Tag drei
3. Serumaushungerung
- Entfernen Sie die Medien vorsichtig mit einem 1 ml-Pipette verwenden und langsam ersetzen mit 300 & mgr; l Serum-freiem DMEM ohne Phenol rot.
- Aufrechterhaltung der Kammer bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 10-12 h.
Vierter Tag
4. Live Cell Imaging
- Stain intrazellulären Kompartimenten (Lysosomen in diesem Fall).
- About 30 min vor Lysosomen in Zellen zu Abbilden, fügen 22,5 & mgr; l von einer 1 uM fluoreszierender Farbstoff-Vorratslösung (0,5 & mgr; l von 1 mM Fluoreszenzfarbstoff in 499,5 & mgr; l serumfreiem DMEM verdünnt ohne Phenolrot) in jede Vertiefung für eine endgültige Farbstoffkonzentration von 75 nM.
- Inkubieren für 25-30 Minuten bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 und dann den Farbstoff sanft entfernen und langsam 300 & mgr; l frisches serumfreies DMEM ohne Phenolrot hinzufügen.
- Bereiten Sie das Mikroskop für die Bildgebung.
- Stellen Sie die Bühne, um Schäden an der Linse bei der Inbetriebnahme eines automatisierten Mikroskop zu vermeiden.
- Schalten Sie das Mikroskop Leistung, Scanner Leistung, Laserleistung und dann Laseremission und schließlich die Metallhalogenlampe für die visuelle Beobachtung (siehe Konfokalmikroskop Anweisungen des Herstellers).
- Öffnen Sie die Imaging-Software-Programm und in der Software wiederum auf dem Argon (488 nm) Laser und Leistung von bis zu 30-50%. Beachten Sie die Leistung hängt davon ab,Alter des Lasers. In Experimenten ist es entscheidend, konstante Einstellungen beizubehalten.
- Schalten Sie rot emittierenden Laser (zB 568 nm oder 594 nm).
- Set Imaging-Format auf 12-Bit-Tiefe.
- Stellen Sie die Pinhole für die Argonlaserlinie 488 nm und für die 568 nm oder 594 nm Laser auf 1 Airy Platteneinheit. Wenn die GFP sehr schwach ist, um eine Einstellung von 2 Airy Platteneinheiten verwenden, aber die Kanäle entsprechend anzupassen.
- Wenn dichroitische Filtersätze verwenden, wählen Sie die entsprechenden Emissionswellenlängen für GFP und dem Fluoreszenzfarbstoff. Oder stellen Sie die Emissionswellenlänge (Em) bei 499-580 nm für GFP und Em 599-680 nm für die rot-emittierenden Fluoreszenzfarbstoff.
- Überprüfen Sie, ob bluten durch und Crossover treten nicht auf. Drehen Sie jeden Laser wiederum aus und prüfen Sie beide Emissionskanäle für jeden. Wenn die Argon-Laser ausgeschaltet ist, sollte die grüne Emission Null sein. Wenn die grün emittierenden Laser ausgeschaltet ist, sollte die rote Emissionskanal Null sein.
HINWEIS: Die sicherste Methode ist zu Bild jeweils in getrennten Spuren (sequential). - wenn gewünscht Fügen Sie ein Hell- Kanal. Vermeiden Differentialkontrastbildgebung (DIC), weil es Kolokalisierung Messungen verzerren können.
- Für die Live-Darstellung, wählen Sie zeilensequenziellen anstatt Frame-Sequential.
- Markieren Sie die Zellen für die Bildgebung.
- Nutzen Sie eine 1,4 numerische Apertur (NA) Ziel, wie ein 63X / 1.4 NA Öl-Objektiv zur Bildzellen (oder 40X / 1.4 NA). das Ziel-Center und einen Tropfen mit hoher Viskosität, geringe Autofluoreszenz Sionsöl auf das Ziel hinzuzufügen.
- Übertragen, um die Kammer mit den transfizierten Zellen aus dem Inkubator auf die Bühne des Mikroskops. Achten Sie darauf, die Folien flach zu halten und sicherzustellen, dass die Kammer fest sitzt und aus der Bewegung zurückgehalten.
- Bewegen Sie das Ziel, bis der Tropfen Öl nur den unteren Rand der Folie berührt; die richtige Brennebene in der Nähe dieser Position. Bei der automatischen Mikroskope, speichern Sie diese Position sowie die abgesenkte Position für die rem verwendenainder des Abbildungsexperiment zu erleichtern Proben verändert.
- Wählen Sie dim Zellen. Die Zellen AT 1a R-GFP überexprimierenden den Rezeptor in der Zelle misdirect und die normale Funktion stören.
- Bestätigen, dass der Umriss der Zelle durch die Plasmamembran definiert ist, ist sichtbar und vorzugsweise nicht mit anderen Zellen überlappen.
- Fokus und die Zelle im Sichtfeld zentriert.
- Wechseln Sie in den konfokalen Modus.
- Wählen Sie eine schnelle Bildgebungsmodus. Mit einer Hand auf der Fokussteuerung und die andere auf der XY-Steuerstufe, konzentrieren und die Zelle von Interesse auf dem Monitor sichtbar gemacht zentrieren.
- Bestätigen Sie, dass die Zelle von Interesse ist gut verteilt und seinem Boden oder Bauchseite eng mit dem Deckglas nebeneinander durch die Konzentration auf und ab durch die Zelle.
- Stellen Sie die z-Stufe Parameter Bild eine Zelle in 3D.
- Markieren Sie die Taste für den Z-Stapel oben und unten Dialog (oder gleichwertig) und konzentrieren sich auf den Boden der cell und drücken Sie "beginnen". Dann konzentrieren sich auf die Oberseite der Zelle und drücken Sie "Ende". Nachprüfen, daß die gesamte Zelle wird in der z-Stapel enthalten sind.
- Stellen Sie die Z-Schrittweite bis 1,0 um.
- Stellen Sie Imaging - Einstellungen.
- Wählen Zoom 2, in Abhängigkeit von der Linse, so dass die endgültige Pixelgröße etwa 0,279 & mgr; m x 0,279 um bis 0,14 um x 0,14 um in der XY-Dimension.
- Für HEK-Zellen in diesem Experiment, Scan-Geschwindigkeit auf etwa 1 & mgr; s pro Voxel gesetzt und wählen Sie 2 Lungs oder 2 Ansammlungen von Linie, je nach Helligkeit der Zellen.
- Passen Laserintensität und gewinnen für die Abbildung GFP und den Fluoreszenzfarbstoff. Im Allgemeinen wird Gegenfärbemittel viel heller und somit Photomultiplier-Detektor (PMT) und nicht Galliumarsenidphosphid (GaAsP) oder Hybrid-Detektoren (HYD) sollte für diesen zweiten Farbkanal genutzt werden, während Keuchen und Hyd Detektoren für den GFP-Kanal erforderlich sind. Wenn die hy oder GaAsP erkennenors werden für den Fluoreszenzfarbstoff, üben Vorsicht und beginnen mit dem Laser, der bei einer extrem niedrigen Leistung.
- Legen Sie Dauer - Scan und die Häufigkeit der Abtastung, beispielsweise alle 30 bis 60 s über 25 Minuten oder länger zu sehen von AT Targeting 1a R-GFP zu Lysosomen.
- Stellen Sie den Autofokus Fokusebene Stabilität im Laufe der Zeit zu halten.
- Beginnen Sie mit der Imaging - Experiment.
- Bereiten Sie im Voraus 100x Ang II Lager bei 5 ug / ul (4,7793 mM) und fügen 2,1 ul dieser zu 998 & mgr; l Medium (10 & mgr; M).
- Beginnen Ligandenstimulation durch die Zugabe von 3 ul einer 100x-Stammlösung des Liganden (Ang II) an die Vertiefung mit 300 & mgr; l unmittelbar vor der Bildgebung (Endkonzentration 100 nM).
- Klicken Sie auf Start und Bild in 3D für die gewünschte Zeit und Frequenz.
- Vor der Arbeit am Mikroskop Finishing, sammeln, um eine Z-Stapel für die spätere Verwendung in Untergrundsubtraktion während der Analyse. In Photonenzählung Modus ist dies nichtnotwendig, da der Hintergrund gedreht wesentlichen 0. Mit Beleuchtung eingeschaltet ist und alle weiteren Abbildungsbedingungen die gleichen sind, aber ohne Probe ein Probenbild aufzunehmen. Siehe Untergrundsubtraktion (unten) unter Analyse.
Fünfter Tag
5. Bildanalyse
- Export Bilder im TIFF - Format.
- Rechtsklick auf die Bilddateinamen Menüs zu sehen, und wählen Sie Exportieren oder klicken Sie auf Datei | Export | einführen.
- Export zu tiff für nachfolgende Analysen sicherstellen, dass die RAW, 12-Bit-Daten zu exportieren [nicht die "Rot Blau Grün '(RGB) Umwandlung zur Veröffentlichung hochwertige Bilder verwendet]. Sie nicht auf JPEG-Format exportieren.
- Beachten Sie die X, Y, Z Voxel Abmessungen und die z-Schrittgröße für die spätere Verwendung während Bildanalyse. Zum Beispiel mit einem 40x / 1.4. NA Objektiv diese Werte könnten 0.138 & mgr; m x 0,138 & mgr; m mit 1 & mgr; m z-Schrittgröße (siehe Daten in den repräsentativen Ergebnissen Abschnitt) sein.
- <Erstellen Sie Bildstapel für die Analyse strong>.
- Bild öffnen Quantifizierungssoftware (Abbildung 2)
- Verwenden Sie "Aktion | Neu erstellen | Bilder von ausgewählten Sequenz" eine einzelne Datei Bild aus importierten Einzelsequenzen zu erzeugen (Abbildung 2, Pfeil # 1).
- Geben die Anzahl der Kanäle, die Anzahl der z-Bereichen, und die Anzahl der Zeitpunkte.
- In Abhängigkeit von der Struktur der * TIFF-Dateien, auswählen, beispielsweise Kanäle, z-Ebene und die Zeitpunkte der Reihenfolge der Bildebenen. Überprüfen Sie, ob die endgültige Bildstapel richtig die Farbkanäle darstellt, Z-Stapel und Zeitpunkte des Originalbildes.
- Wählen Sie den Bildnamen (Abbildung 2, markierte Dateiname auf der linken Seite, Pfeil # 2). Rechtsklick auf das Bild und / oder das Bildfeld und aus den Optionen am unteren Ende der Liste wählen Sie "Eigenschaften". In der um Pixel für (X) (Y) und (Z) Größe, geben Sie die richtige Bildeigenschaften oben erwähnt.
- Subtrahieren Hintergrund vor der Bildanalyse. Hintergrundkorrektur kann in jeder Bildanalyse - Software durchgeführt werden. Subtrahieren Hintergrund eine von zwei Optionen.
- Option 1: Wählen Sie "Aktion | Neu erstellen | Untergrundsubtraktion" (Abbildung 2, Pfeil # 1). Verwenden Sie die erworbenen Hintergrundbild am Ende der Imaging-Sitzung erhalten oben beschrieben als "Dark Reference" Bild unter "Extras | Hintergrund subtrahieren".
- Option 2: Überprüfen Sie die dunkelsten Bereiche in den Bildern, wo es keine Probe vorhanden ist, finden die mittlere oder maximale Helligkeit von Pixel in diesem Bereich, keine ungewöhnlich helle Pixel zu ignorieren, die unechte Fluorophor sein könnte, ein zufällig helles Pixel oder ein anderes Phänomen. Wählen Sie "Aktionen | Neu erstellen | Untergrundsubtraktion". Verwenden Sie diese Pixelhelligkeit (negativ gemacht) als Offset.
- Überprüfen Sie, ob die Farbregistrierung und ggf. korrigieren.
- Generieren Sie eine Registrierung Korrektur durch die Auswahl von "Aktionen | Neu erstellen | Registrierung Correction" (Abbildung 2, Pfeil # 1) und verwenden Sie das Dialogfeld Einstellungen vornehmen können . Nach Abschluss erscheint ein neuer Ordner Punkt "Registration-Korrektur" berechtigt.
- Tragen Sie die Anmeldung an einen oder mehrere der Bilder von Interesse durch den Bildnamen klicken (Abbildung 2, markierte Dateiname auf der linken Seite, Pfeil # 2) und dann "Extras | korrekte Registrierung" (Tool - Taste neben Actions).
- Wählen Sie ein Bild (Abbildung 2, hervorgehoben Dateinamen auf der linken Seite, Pfeil # 2) und eine Region of Interest (ROI) ziehen um eine einzelne Zelle , die Freestyle - Region - Werkzeug (Abbildung 2, Pfeil # 3). Verwenden Sie den erweiterten Fokusmodus (2D, Drop-Down-Menü in der oberen linken), um die Zelle zu beobachten, wie das Zuschneiden Werkzeug nur in 2D-Visualisierung arbeitet.
- Rechtsklick auf das Bild und wählen "Auf Auswahl zuschneiden" und ein neues Bild Element erzeugt wird.
- Wählen Sie die beschnittene Zelle , indem Sie auf den Namen klicken und wählen Sie dann die "Messung" Tab oben (Abbildung 2, Pfeil # 4).
- Zur Definition und internalisiert Vesikel für GFP messen, ziehen "Find Objects" unter "Suchen" (Abbildung 2, Pfeil # 5) in Folge Feld (Abbildung 2, Pfeil # 6).
- Set "Find Objects" Kanal auf dem GFP-Kanal.
- Einstellungen öffnen (Rad-Symbol im Dialogfeld, Pfeil # 6) und setzen4; Ansprechschwelle: "SD und" untere Grenze "bis 6. Set" Minimale Objektgröße "auf 0 & mgr; m 3.
HINWEIS: Die SD-Untergrenze für einzelne Experimente ab. Visuelle Bestätigung , dass die richtigen Objekte gethresholdeten durch Untersuchen verschiedenen Zeitpunkten (2, Pfeil # 7) hergestellt ist. Die "Mess | Feedbackoptionen" Dialogfeld wird verwendet , um die Art und Weise zu wählen , die schwellen Objekte ausgewählt werden visualisiert (Abbildung 2, Pfeil # 8). - Klicken Sie auf "Messen" in "Suchen von Objekten" Dialogfeld (Abbildung 2 Pfeil # 6) und wählen Sie die Kanäle und die Art der Messungen. Normalerweise wählen Sie "Alle Kanäle" und "Intensität und Volumenmessungen".
- Um die Schwellwertbildung und Filter zur Identifikation der gesamten Zelle definieren und die Gesamt GFP Intensität zu messen, wiederholen Sie die obigen Schritte (5.5.4 - 5.5.8) mit den folgenden Parametern: SD 0 und "Mindestobjektgröße" bis 2 μ; m 3 in der zweiten "Find Objects" Dialogfeld Zellen mit GFP (Abbildung 2, Pfeil # 9) zu identifizieren
- Ziehen "Filter Bevölkerung" unter "Filter" , um die Sequenz - Box unter Population 2 (die zweite "Find Objects" Feld, Bild 2, Pfeil # 9). Wählen Sie "Volume (um 3> 100).
- Optisch sicherzustellen, dass nur ein Objekt identifiziert wird. Die gesamte Zelle sollte Schwellwertbildung und alle anderen Objekte weggefiltert werden. Der "Filter" Parameter (n) muss möglicherweise angepasst werden, wenn die Zelle klein ist, zum Beispiel.
- Nachdem die Messung standardisiert wurde, speichern Sie das Protokoll, das von rechts auf das Bild klicken, und wählen Sie "Protokoll speichern", um wieder zu verwenden ( "Restore-Protokoll"). Das Protokoll kann auch eine Aufzeichnung im gleichen Unterverzeichnis wie das Bild zur Verfügung zu stellen exportiert werden.
- Fahren Sie mit "Make Measurement" durch Auswahl von "Messungen | Make Mess Item" (Abbildung 2
- Geben Sie den richtigen Messnamen (kopieren und einfügen aus dem Bild ist praktisch) und Analyse-Code oder Datum (eine hilfreiche Ergänzung für die Aufzeichnung) und wählen Sie "allen Zeitpunkten". Ein neues Arbeitsblatt-Eintrag wird unter dem Bild erstellt werden. Halten Sie die Dateinamen prägnant.
- Klicken Sie auf das Arbeitsblatt Dateinamen und wählen Sie die "Analyse" aus. Bestimmen Sie, ob gesättigt Voxel vorhanden sind, indem man zuerst die Auswahl "Beschränken Analyse zu:" wählen Population 2 (die Zelle).
- Rechtsklick auf das Feld unter dem "Registerkarte Analysieren" und im Dialogfeld unter "Analysieren dieser Daten:" die Option "Max ([GFP Farbkanal])"; unter "Verdichtete von:" select "Mean ([GFP Farbkanal]", und unter "Organisieren der Daten durch:" und "Row" wählen Sie "Timepoint" und click "OK".
HINWEIS: Wenn Daten gesättigte Pixel (zB 65536 für 16-Bit oder 4.096 für 12-Bit) enthält, wird die Analyse nicht genau sein (es wird Gehalt unterschätzen Vesikel). Außer Acht lassen, dass die Zellen für die Analyse. Wenn nicht gesättigt ist, mit dem nächsten Schritt fortzufahren. - Als nächstes unter der "Raw" und dann unter "Analyse" klicken und einen Rechtsklick auf die Daten finden "Analyse Einschränken auf:" und wählen Sie dann Population 1 für Vesikel oder Bevölkerung 2 für die gesamte Zelle.
- Unter "Analysieren dieser Daten:" wählen Sie "Sum" (GFP Farbkanal); unter "von fasste zusammen:" wählen Sie "Sum"; und unter "Organisieren der Daten durch:" und "Row" wählen Sie "Timepoint" oder "Relative Zeit" und klicken Sie dann auf "OK". Analyse Auswahlen können gespeichert und wiederverwendet werden.
- Auswählen und Kopieren / Einfügen direkt von der Bildquantifizierungssoftware auf eine leere Tabelle oder exportieren Sie die Tabellendaten nach rechts, um die dat klickenein und die Auswahl speichern als CSV-Datei. Die ganze Zelle Intensitätsmessung wird mit Messungen der einzelnen Bläschen in der Bevölkerung aufgenommen werden, so sicher sein, es zu identifizieren und getrennt von den Bläschen.
Hinweis: Nachdem der grafischen Darstellung von Daten, die Zunahme der Fluoreszenz Gesamt GFP in Vesikeln enthalten sind schnell ansteigt. Photobleaching, wenn sie auftritt, wird als Verlust von Gesamtzell GFP Intensität über die Zeit nachgewiesen.
- In den Find Objects (Population 1), stellen Sie "Find Objects" Kanal auf den roten Kanal und in den Rad - Symbol in der durch den Pfeil # angezeigt Dialogfeld 6 (Abbildung 2) Satz "Threshold mit:" SD und "untere Grenze" zu 6. Stellen Sie "Minimale Objektgröße" bis 0,017 & mgr; m 3.
HINWEIS: Die SD-Untergrenze für einzelne Experimente ab. Visuelle Bestätigung, dass die richtigen Objekte werden Schwellwertbildung werden, sollten durch Prüfung gemacht werdenining verschiedenen Zeitpunkten. Die "Mess | Feedbackoptionen" Dialogfeld wird verwendet , um die Art und Weise zu wählen , die schwellen Objekte ausgewählt werden visualisiert (Abbildung 2, Pfeil # 8). - Klicken Sie auf "Messen" in "Suchen" Objekte "Dialog (Abbildung 2 Pfeil # 6) und wählen Sie die Kanäle und Arten von Messungen. In der Regel" Alle Kanäle "und" Intensität und Volumenmessungen "ausgewählt.
- Für Bevölkerung 2, dass die Verwendung Einstellungen identisch verwendet , um die gesamte transfizierten Zelle exprimiert AT 1a R-GFP (5.5.9) zu identifizieren.
- Wenn mehrere Zellen (einschließlich nicht-transfizierten Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff-positive Vesikel) vorhanden sind, in der ersten Stufe der Analyse des Zell Beschneiden ist kritisch. Alternativ sollte die Verwendung von "compartmentalize" verwendet werden , Identifizierung von Lysosomen in der transfizierten Zelle zu begrenzen AT 1a R-GFP exprimieren. Lysosomen darf nur innerhalb der GFP Zelle identifiziert werden undnicht aus der Nähe, untransfizierten Zellen.
- Analyse und Export wie oben Daten.
HINWEIS: Ein Beispiel für eine Schwellwertbildung Zellen und Vesikel ist in Abbildung 4 dargestellt.
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Representative Results
In dieser repräsentativen Reihe von Experimenten wurden HEK - Zellen mit Angiotensin - Typ 1a - Rezeptor transfiziert (AT 1a R-GFP) konstruieren (E1,2,3-AT 1a R) in das Plasmid pEGFP-N2 geklont 13. Zeitraffer-Bilder von HEK wurden erworben und spielte als Film (Siehe Live Cell Imaging 1 und Live Cell Imaging 2 Filme). Die Filme und Standbilder zeigen , dass nach Ligand - Stimulation, AT 1a R-EGFPs überwiegend lokalisiert sind in der Plasmamembran, aber mit dem Zusatz von Ang II diese innerhalb von 2,5 min werden Rezeptoren internalisiert helle Bläschen zu bilden und zu späteren Zeitpunkten Cluster in größeren Bläschen in eine perinukleäre Zone (4B, 5 und 6A; Live Cell Imaging 2).
Die Quantifizierung der Gesamtzell GFP Intensität und Gesamt Vesikel GFP Intensität für die Zelle in Abbildung 5 peine Darstellung der Komplikationen inhärenten rovide wenn Ang II induziert zerzauste und Zellformänderungen unmittelbar nach der Stimulation (5A, Pfeil bei 0 min nach Ang II, obere Reihe, orange zeigt schwellen Objekte). Zu späteren Zeitpunkten, die Lokalisierung von GFP-enthaltenden Vesikeln in einem perinukleären Cluster stört auch (5A, roter Pfeil bei 29,5 min). Obwohl alle Objekte in der gesamten Zelle GFP Intensitätsmessung einbezogen werden sollten, sollten die Rüschen aus Vesikel Messungen ausgeschlossen werden , da sie Plasmamembran AT 1a R-GFP darstellen. Im Gegensatz dazu sollten die gruppierten perinukleäre Vesikel nicht aus dem Vesikel Messung ausgeschlossen werden (letztere in einem Bereich der Zelle in roten Kreisen in 5A eingeschlossen zu sehen sind, Pfeil bei 29,5 min nach Ang II, untere Reihe). Versuche , diese Filterung nach Größe zu erreichen (mehr als oder weniger als 7 & mgr; m 3) war nicht nützlich , da es nicht Rüschen und gruppierten v diskriminieren könnteesicles (5A und 5B, zu vergleichen Filter> 7, Filter <7 und kein Filter). Eine mögliche Alternative wäre eine Regions of Interest (ROI) zu zeichnen den zytoplasmatischen Teil der Zelle umfasst, sondern die zerzauste Rand und Umfang der Zelle auszuschließen. Letztlich würde diese Zelle nicht in quantitativen Ergebnissen enthalten sein, da Pixel von GFP vorhanden gesättigt waren.
Ein zweites repräsentatives Beispiel ist in 6A veranschaulicht ein Zeitverlauf dargestellt , bei der der Autofokus nicht verwendet wurde. Die internalisiert GFP als Prozent der gesamten zellulären GFP (6B) gezeigt. Die Zeitpunkte vor dem roten Pfeil in 3 min sind irreführend, da nur ein Teil der Zelle war in dem Bildgebungsvolumen, aber 3 min nach Ang II hinaus ist die Brennebene wieder stabilisiert. Die gesamte GFP in der Zelle zeigt , daß diese Zelle nicht nennenswert war photobleach über die Zeit (6C ). Zwischen 3 und ca. 12 min, Prozent GFP Intensität in Vesikeln steigt dann stark an (6B). Als nächstes wurden durch Fluoreszenzfarbstoff identifiziert Lysosomen verwendet ROIs innerhalb einer transfizierten Zelle zu identifizieren , die dann für die Summe der GFP - Intensität (6D) quantifiziert wurden. Nach drei Minuten variiert die Intensität der AT 1a R-GFP in roten identifiziert Lysosomen nicht im Laufe der Zeit (3D, n = 5, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts). Somit gibt es keine nachweisbare Erhöhung der Abgabe von AT 1a R-GFPs in die Lysosomen für bis zu 24 Minuten nach der Verabreichung Ang II.
Abbildung 1: Gesättigte Pixels Identifizierte in einer Nachschlagtabelle (LUT). Der rote Pfeil zeigt gesättigte Pixel in blau dargestellt.t = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Übersicht der Bildquantifizierungssoftware. Wesentliche Positionen werden durch Zahlen angegeben und innerhalb der Methoden Text diskutiert. 1) Aktion Artikel, 2) Ausgewählte Bild, 3) Freihand ROI-Tool, 4) Registerkarte Messungen, 5) Objekte zu finden, 6) Bevölkerung 1 Suche Dialogfeld Objekte 7) Pfeil Aktivierung Zeitraffer-Film, 8) Messungen Artikel, 9) eine zweite Suche Dialogfeld Objekte einen Filter Bevölkerung Befehl enthält. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Farbregistrierungskorrektur. Weitere Bilder mit unkorrigierten undkorrigierten Pixel Anmeldung sind zusammen mit Einsätzen von mehreren colocalizing Vesikel enthalten , AT 1a R-GFP gezeigt. Die roten Bildpunkte 1 Pixel nach links in der XY-Ebene des unkorrigierten Bild verschoben. Einschübe zeigen geschachtelte Flächen bei höherer Vergrößerung. Maßstabsbalken = 3,3 um, Voxeldimensionen = 0.138 x 0.138 x 1 & mgr; m 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Abbildung von Thresholding zu identifizieren GFP- und Fluoreszenzfarbstoff enthaltenden Vesikeln und GFP-ganze Zellen. (A) Identifizierung von ganzen Zellen AT 1a R-GFP unter Verwendung von (GFP, obere Reihe) und Schwellwertbildung GFP für die ganze Zelle (ID Cell, untere Reihe) werden bei 0 und 2,5 min gezeigt nach Ang II hinaus. Weiße Kästchen zeigen Inset Bereiche in (B) gezeigt , und (C). (B) AT 1a R-GFPs sind im Vergleich zu 0 und 2 5 min nach Ang II zusätzlich in einzelne Farbbilder (obere Reihe). Vesikeln durch Schwellwertbildung identifiziert werden in der unteren Reihe (ID Ves, violett) angezeigt. (C) Zweifarbbilder (AT 1a R-GFP / Fluoreszenzfarbstoff) werden bei 0 und 2,5 Minuten nach Ang II zusätzlich gezeigt. Lysosomen durch Schwellwertbildung identifiziert werden durch rote Konturen gezeigt. Maßstabsbalken = 7,0 um, Voxeldimensionen = 0,114 x 0,114 x 1,4 um 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Darstellung der Auswirkungen von Rüschen und Clustered Vesikeln auf Messung der internalisierten GFP - Rezeptoren. (A) A T 1a R-GFP in Ang II behandelten Zellen bei 0 (obere Reihe) und 2,5 min (untere Reihe) sind in drei Filter Experimente gezeigt , wo in der ersten Spalte ein Filter angewendet wurde nur zu wählen Objekte größer als 7 & mgr; m 3, in der zweite Spalte auszuwählen Objekte weniger 7 um 3, und in der dritten Säule wurde kein Filter verwendet. Thresholding Niveau war in allen drei konstant. Die Pfeile zeigen die großen schwellen Objekte, Kreise zeigen eine Fläche von Zytoplasma perinukleäre Vesikeln zu späteren Zeitpunkten enthält. Schwellenwert Bereiche sind orange. (B) Quantifizierung der GFP Gesamtintensität in Vesikeln für schwellen Bereiche gezeigt , mit oder ohne Größenfilterung (durch Spalte in A) zu zwei Zeitpunkten ( für Reihe in A). Voxeldimensionen waren 0.138 x 0.138 x 1 & mgr; m 3. Maßstabsbalken = 5,6 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Verfolgen AT1 eine R- GFP Internalisierung und Potential Lokalisierung in Lysosomen. (A) fünf ausgewählte Zeitpunkt von AT 1a R-GFP mit LysoTracker Red werden aus dem begleitenden Film (Mikroskopische Untersuchungen von Zellen 1 Film) bei 0, 3, 6, 9, und 12 min nach Ang II gezeigt. Das Gitter stellt eine Einheitsskala von 6,56 & mgr; m 3, Voxel Abmessungen waren 0,297 x 0,297 x 1,2 & mgr; m 3, und die Z-Stufe = 1,2 & mgr; m. (B) Ein Plot der prozentualen Gesamt GFP in Vesikeln über die Zeit veranschaulicht die rasche Internalisierung von AT 1a R-GFP. (C) eine graphische Darstellung des Gesamt GFP in der Zelle im Laufe der Zeit zeigt , dass relativ wenig Photobleaching während 24 min von Abbildungs aufgetreten ist . (D) Lysosomen wurde durch die Identifizierung LysoTracker Red-positiven Vesikel identifiziert. Die Gesamtintensität innerhalb GFP fluorescent Farbstoff-positive Vesikel ROIs wurde zu jedem Zeitpunkt (Normalized zu dem ersten Zeitpunkt ohne Entschädigung für Photobleaching, die nicht unabhängig gemessen wurde) gemessen. (C - D) Vor dem Pfeil, die Messungen sind nicht gültig , da der Fokus verschoben. N = 5, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: Live Cell Imaging 1: (Rechtsklick zum Download) HEK Zelle transfiziert mit AT 1a R-GFP bebildert alle 1 min 24 min (25 Bilder) nach der Zugabe von 100 nM Ang II. Film wurde unter Verwendung eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop erworben mit einem Plan-Apochrombei 63X / 1.4 NA Öl - Objektiv, Voxeldimensionen von 0.279 x 0.279 x 1,2 um 3; und 5 Scheiben für insgesamt 4,794 & mgr; m Dicke bei 3,20 & mgr; s / Pixel abgebildet. Der Film kostet 2 Bilder / s. Einheit = 6,56 & mgr; m.
Film 2: Live Cell Imaging 2: (Rechtsklick zum Download) HEK Zelle transfiziert mit AT 1a R-GFP abgebildet wurde alle 30 s für 25 min (51 Frames) nach der Zugabe von 100 nM Ang II. Film wurde mit einem Plan-Apochromat 40x / 1.4 NA Öl-Objektiv mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop erworben. Voxeldimensionen waren 0,11 x 0,11 x 1,4 um 3. 7 Scheiben für insgesamt 8,4 um Dicke wurden bei 3,72 s / Rahmen abgebildet. Der Film kostet 3 Bilder / s. Maßstabsbalken = 7 & mgr; m.
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Discussion
Vorversuche hier vorgestellten zeigt , dass über einen ziemlich kurzen zeitlichen Verlauf von 24 min, keine nennenswerte Veränderung der Lieferung von AT 1a R-GFP zu den Lysosomen aufgetreten. Im allgemeinen Lieferung von internalisierten Rezeptoren Lysosomen könnte bereits 15-20 Minuten auftreten. Dieses Experiment ist in Einklang mit der Hypothese , dass der Großteil der AT R 1a internalisierte zu groß, perinukleären Endosomen ausgerichtet ist. Hinweise darauf , dass zumindest einige AT 1a R in Lysosomen kommt von Li wurde demonstriert et al. Die, verglichen Zellen bei 5 min und 30 min nach der Behandlung und Ang II fanden signifikante Kolokalisation von LAMP1 mit AT 1a R bei 30 , aber nicht mehr als 5 min 6.
Dieses Dokument enthält eine detaillierte Beschreibung der Zellpräparation, Bildgebung und Analyseschritte und diskutiert die viele inhärenten Gefahren in dieser fortschrittlichen Abbildungstechnik. Dieses Verfahren hängt von kritischen Schritte im Folgenden erörtert.
Da die gute Gesundheit der Zellen für jede Live Cell Imaging Experiment kritisch ist, ist es wichtig, aufgrund von Veränderungen der Wachstumsraten und Transfektionseffizienz bei höheren Passagen unter Verwendung von Zellen über Kanal 11 zu vermeiden. Um gesunde Zellen während des gesamten Versuchs erhalten, die Inkubationszeit von Transfektionsgemisch mit Zellen sollten nicht mehr als 5 h nicht überschreiten, da Liposom-Lösung zu den Zellen nachgewiesen durch erhöhte Membran blebbing toxisch ist. Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2 -Regelung ist signifikant sowohl vor als auch während der Bildgebung. Drifts in der Temperatur während der Bildgebung kann dazu führen, relativ großen z-Abschnitt Drifts und Verlust der Fokusebene Stabilität. Daher besondere Vorsicht während der Zugabe von Ang II zu den Zellen während der Bildgebung empfohlen, um sicherzustellen, dass die Brennebene genau eingehalten wird.
Imaging
Ein Vorteil von Live-Cell-Imaging über Immunfärbung fixierten Zellen unter Verwendung istwerden kann , dass die in - vivo - Bedingungen genau kontrolliert und Artefakte mit fixierten Zellen verbunden sind, können vermieden werden. Allerdings können Live-Cell-Imaging eine Herausforderung sein, für zelluläre Prozesse zu optimieren, die extrem schnell sind, wie Rezeptorinternalisierung. Instrument Geschwindigkeit und die Notwendigkeit Grenze zu vermeiden Photobleaching die Auswahl von Ereignissen, die untersucht werden können. Jedes Imaging Experiment könnte bestimmte Entscheidungen verlangen in einigen Parametern und Kompromisse in anderen gemacht werden; Beispiele sind Entscheidungen in Pixel, Linie Ansammlung, Zoomfaktor, und Scangeschwindigkeit auf Daten von guter Qualität für die Analyse erhalten und vermeiden Überabtastungs zugleich Größe. Kritische Entscheidungen in dieser Faktoren hängt von der Notwendigkeit für den Erhalt der ausreichenden Pixelgrße Auswuchten einzelnen Vesikeln zu unterscheiden und die Notwendigkeit für eine ausreichende zeitliche Auflösung der Ereignisse zu erhalten, die auftreten. So einige Kompromisse müssen gemacht werden, um Informationen schnell genug, um zu erfassen, wenn die Zelle GFP-markierten Rezeptor internalisieren beginnt. In unsererFall ist , obwohl moderne konfokalen Software die optimale Pixelgröße vorschlagen kann, verwendet , um unsere Experimente einen Wert kleiner als die optimale Pixelgröße entsprechend der Nyquist - Gleichung 14. Optimale Wahl der Einstellungen für andere Experimente hängt auch davon ab, wie hell die Zellen sind da größere Pixelgröße schnellere Ansammlung von Photonen ermöglichen, einen Kompromiß mit längeren Voxel Verweilzeit ermöglicht, um mehr Photonen zu sammeln.
Für die Analyse erfolgreich zu sein, erfordert die Live-Cell-Imaging auch kritisch genaue Fokus Stabilisierung während der Zeitraffer-Bildgebung. Focal Verschiebungen sowie Versagen Bild kann die ganze Zelle haben großen Einfluss auf die Quantifizierung von Rezeptor Internalisierung sowie die gesamte zelluläre GFP Intensität. Die Lösung für dieses Problem der Fokusverschiebungen während der frühesten Zeitpunkte der Bildgebung nach der Zugabe von Ang II wurde durch konfokale Herstellern in Form von Autofokus-Lösungen, wobei Deck interferom versehen wordentrie mit einem IR - Laser gekoppelt mit Feedback zur automatischen Fokussteuerung wird verwendet , um aus dem Ziel zu der Deckfläche durch die IR - Reflexion (zB Definite Focus oder Adaptive Focus Control) identifiziert relativen Abstand zu halten. Das verbleibende Problem des microscopist ist dann die richtige z-Bereich zu identifizieren, so dass trotz Formveränderungen, die gesamte Zelle in dem Bildgebungsvolumen bleibt. Die Temperatur ist ein weiterer wichtiger Faktor, der den Fokus / Z-Position während der anfänglichen Zeitpunkten nach der Zugabe von Ang II zu erhalten. Die Temperatur des Objektivs sowie die Live-Cell-Imaging-Kammer sollte während des gesamten Versuchs bei 37 ° C gehalten werden.
Ein weiterer wichtiger Bestandteil der Bildgebung, erwirbt Bilder quantitativ. Wenn ein HYD Detektor im Photon Counting-Modus verwendet wird, müssen die Abbildungsparameter so eingestellt werden, dass Photonen-Pile-Up nicht auftritt. Für PMTs und andere Detektoren enthalten die Bilder müssen nicht gesättigt Pixel (Voxel). In beiden Fällen wird ein spezial Look-Up-Table (LUT) verwendet werden kann, um das Vorhandensein von gesättigten Pixeln und natürlich sichtbar zu machen, wenn sie vorhanden sind, sollte die microscopist Laserintensität und / oder die Verstärkung zu reduzieren.
Analyse
Obwohl der hier beschriebene Ansatz für die AT 1a R - Rezeptor und seine Kolokalisation mit Lysosomen angewendet wird, ist es für Experimente , in denen die relative Menge des Rezeptors in subzellulären Kompartimenten mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen markiert in Frage. Wenn das Ziel, ob die Rezeptor bewegt sich zu dem Organell zu messen ist, dann mit einem Marker ein Pearson-Kolokalisation Koeffizienten, für die Organell ist problematisch. Jedes Pixel in dem der Organell identifiziert wird, eine hohe Menge des Markers aufweisen, so daß einer der Koeffizienten werden immer in der Nähe von 100% liegen. Somit könnte Kolokalisation Messungen irreführend sein. Auf der anderen Seite, die Messung der Prozent des Rezeptors auf der Organell gegenüber Gesamtmenge an receptor ist viel informativer und übersichtlicher zu interpretieren. Ein Fall , in dem Protein Kolokalisation am besten beschrieben werden könnte , Pearson-Korrelationskoeffizient unter Verwendung würde AT 1a R - Rezeptor und sein LAMP1 Wechselwirkung dessen ist dokumentiert worden, wenn auch mit einem anspruchsvolleren Ansatz Kolokalisation, nämlich FLIM / FRET 6.
Die Verwendung von 3D - Bildgebung ist genauer als die Verwendung von repräsentativen Scheiben von Zellen mit der Analyse in 2D , weil der zellulären Bewegungen , die während des Zeitverlaufs (Live - Imaging 2 Film) unvermeidlich sind. Es ist klar aus den lebenden Zellen Bilder in den 3, 4B und 5A, die den Rezeptor in erster Linie an der Plasmamembran lokalisiert ist, jedoch innerhalb weniger Minuten nach Exposition gegenüber Ang II sie helle Flecken auf der Membran lokalisiert und kleine Vesikel an die Membran angrenzenden, wahrscheinlich beschichteten Gruben und frühen Endosomen (4B 4C). Bei fortgesetzter Fortschreiten der Zeit bewegen sich die Vesikel durch die Zelle in größeren Vesikel neben dem Kern ansammelt , die als multivesicular Endosomen beschrieben (MVEs, Figuren 1, 5A) , 3, 15. Eine einzige Scheibe durch die Zelle im Laufe der Zeit die Internalisierung Prozess und entstellen die wahren Ereignisse besonders verzerren würde, wenn die Scheibe nicht die Zelloberfläche zu frühen Zeiten, und die MVEs zu späteren Zeitpunkten enthalten waren.
In dieser Studie wurden zwei Ansätze für die Bildanalyse können Effekte von Photobleaching von GFP sowie Fluoreszenzfarbstoff auf dem quantitativen Ergebnis zu minimieren. Als Zellen (wenn auch in begrenztem Umfang) photobleach wird die relative Helligkeit von internalisierten Vesikeln bezogen auf die gesamte Zell Intensität aufrechterhalten wird, unter der Annahme, Photobleaching gleichmäßig auftritt. Fluoreszenzfarbstoff-positive Vesikel sind ebenfalls leicht zu erkennen durch den Standard deviatio Auswahln der mittleren Fluoreszenzintensität Option für helle internalisierten Vesikeln Schwellwertbildung. Dies unterscheidet sie von Hintergrund auch als das gesamte Niveau der Fluoreszenz abnimmt. Somit waren unsere Messungen der Auswirkungen der bescheidenen Photobleaching nicht empfindlich. Jedoch starke Photobleichens wie 50% Verlust der Zell Intensität im Laufe der Zeit könnte einen größeren Einfluss auf quantitative Ergebnisse haben. Alternativ könnten die Wirkungen von Photobleaching gemessen werden unabhängig in Kontrollexperimenten Ang II im Falle von AT 1a R-GFP oder in benachbarten nicht - transfizierten Zellen im Fall von Fluoreszenzfarbstoffen nicht vorhanden. Die Auswirkungen von Photobleichens könnte dann während der Analyse einkalkuliert werden.
Weitere Bedenken
Vor kurzem haben Zellbiologen kritische Bewertung und Modifizierung von fluoreszierenden Proteinen durchgeführt zur Überwachung der Membrantransport in Zellen Artefakte, die durch das fluoreszierende Protein selbst, unabhängig von der Protein bein erzeugt zu vermeideng markiert. Verschiedene fluoreszierende Proteine sind anfällig für Wechselwirkungen mit der lokalen Mikroumgebung zur Proteinfällung führt oder Vernetzungs basierend auf ihren pKa-Werten und Anwesenheit der Aminosäure Cystein, bzw. 16. Ein weiteres Ergebnis dieser Wechselwirkungen kann es zum Verlust der Fluoreszenz 16 umfassen. Alle diese Artefakte beeinflussen quantitative Messungen des Menschenhandels. Constantini et al. monomeren fluoreszierende Proteine für die Bildgebung erzeugt haben , die Cystein fehlen 16 mögliche Artefakte zu beseitigen. Somit, abhängig von dem Ziel der Abbildungsexperimenten von EGFP (non-monomer) zu einem monomeren Schalt, Cystein-freien Form würde für Studien von sauren und / oder reduzierenden vesikulären Mikroumgebungen vorteilhaft sein. Ein weiteres Beispiel wäre die verbesserte Dienstprogramm für FRAP oder FRET-Experimente, in denen Multimerisierung und Vernetzungs würde Proteindiffusion und Protein-Protein-Wechselwirkungen beeinflussen.
Ein weiteres potentielles Artefakt zu berücksichtigen , wenn Lysosomen Abbilden LysoTracker Red zusammen mit GFP - Fusionsproteine ist , daß LysoTracker Red wurde der Photokonversion zu Grün 17 fähig erwiesen. Die Autoren empfehlen, dass die Verwendung von Epifluoreszenz Beleuchtung minimiert werden, Vorkommen dieses Artefakt zu diskutieren, und verweisen auf erfolgreiche Beispiele von Co-Lokalisation dieses Reagenz verwendet wird. Zusätzlich können andere Marker der Lysosomen können auch Kolokalisation Ergebnisse verwendet werden , um zu überprüfen, beispielsweise tagged LAMP1 6.
In Zukunft kann die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays für Rezeptor sowie andere subzellulären Targeting zu Lysosomen sucht werden durch Inhibitoren der Vesikeltransport und / oder Fusion, durch die Hemmung der Lysosom Ansäuerung mit Bafilomycin zu blockieren Abbau aber nicht Akkumulation 7, 18 unter Verwendung von durch Chloroquin verwendet folglich Fusion mit Lysosomen mit Lysosomen 2, 5, 6, 7, 18, unter Verwendung von positiven Kontrollen wie die Ausrichtung von markiertem Ang II zu Lysosomen 2 und durch den Vergleich mit anderen gut blockiert Kolokalisation von Rezeptor zu blockieren -described Rezeptor- und Ligandensysteme wie Transferrin oder epidermaler Wachstumsfaktor und ihre verwandten Rezeptoren 3. Eine interessante positive Kontrolle einlbeit artifizielle, in unseren Versuchen war das Ergebnis in benachbarten beobachtet, untransfizierten, AT 1a R-GFP - negativen Zellen. Diese Zellen nahmen offenbar auf GFP aus transfizierten Zellen freigesetzt und gezielte es Lysosomen, wo Kolokalisation mit Fluoreszenzfarbstoff ziemlich prominent war (nicht gezeigt). Diese Kolokalisation war jedoch zu Ang II nicht empfindlich wie erwartet.
Abschließend werden die Verfahren für die Transfektion, Bildgebung und Bildanalyse hier vorgestellt werden, bieten Mittel, durch die Internalisierung des Rezeptors an verschiedenen subzellulären quantitativ innerhalb von lebenden Zellen im Laufe der Zeit zurückverfolgt werden. Relative Vergleiche zwischen verschiedenen Rezeptoren oder selektiv mutierten Rezeptoren sind möglich im Hinblick auf die Kinetik und die subzelluläre Lokalisierung auf bestimmte Kompartimente. Mögliche Schwierigkeiten und Artefakte mit dieser Technik verbunden sind, diskutiert. Dennoch schnelle Live-Bildgebung in 3D mit Bildanalyse gekoppelt verwendet werden Rezeptor-Aufnahme und schnelle MessungÜbergänge durch das Cytoplasma definierbaren Kompartimente molekular. Dies schafft die Voraussetzung für die Messung von Differenzen aus Mutation des Rezeptors oder der Anwendung von Agonisten, Antagonisten und Inhibitoren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Forschungsarbeiten in diesem Manuskript präsentiert wurde von Grant R01 HL121456-01A1 Kathryn Sandberg unterstützt. Diese Arbeit wurde zusätzlich durch die Verfügbarkeit eines Leica SP8 AOBS in der Mikroskopie und Imaging Shared Resource (MISR) an der Georgetown University Medical Center unterstützt, die zum Teil von P30-CA051008 von den National Institutes of Health der Vereinigten Staaten von Amerika finanziert wird. Wir danken SP8 Imaging-Unterstützung Leica von Peter Johnson, und die Verwendung des Zeiss LSM880 im Labor von Thomas Coate, Institut für Biologie an der Georgetown University mit Hilfe Bildgebung durch Alma Arnold von Carl Zeiss Mikroskopie LLC zur Verfügung gestellt. Der Inhalt in diesem Manuskript ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
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