Summary
여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.
Abstract
라이브 셀 이미징 동시에 안지오텐신 II (중앙 II) 자극 다음 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK) 세포에서 안지오텐신 1a 형의 (1A의 R AT) 수용체 및 세포 내 구획의 시간 경과 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. HEK 세포를 일시적으로 플라스미드 DNA 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 태그 (1A)의 R AT 함유 형질. 리소좀은 빨간색 형광 염료로 식별됩니다. 라이브 셀 이미지는 중앙 II 자극 후 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 포착 시간이 지남에 따라 세 가지 차원 (3D, 복셀)에서 소프트웨어로 분석된다. 라이브 세포 이미징 수용체 피킹으로 조사 할 수 있으며 정착과 관련된 교란을 방지하고, 특히, EGFP 태그가 막 수용체의 손실 또는 artefactual 변위. 각 셀은 시간을 추적 같이 따라서, 수용체의 세포 내 지역화 묘화하고 측정 할 수있다. 이미지는 sufficientl을 취득해야합니다Y는 빠른 속도로 빠른 소포의 움직임을 촬영합니다. 그러나, 빠른 속도로 영상을 수집 된 광자의 수는 감소된다. 절충안은 이미징 속도를 얻기 위해 같은 복셀 사이즈 촬상 파라미터의 선택에서 이루어져야한다. 라이브 세포 이미징의 중요한 응용 프로그램 이름하지만 몇 가지로 단백질 인신 매매, 이동, 증식, 세포주기, 세포 사멸, 자식 작용 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 역학을 공부한다.
Introduction
전반적인 목표는 수용체 작용제 치료 후 시간과 특정 세포 내 소기관과 수용체의 colocalization을의 공간에서 정량적 증거를 획득하는 것입니다. 따라서, 여기에 즉시 목표 경과 촛점 리소좀의 이미지와 인간 배아 신장 세포에서 수용체 (HEK) 정량적으로 수용체의 전달을 측정하기 위하여 3 차원의 화상 데이터를 형질 다음이어서 조립 분석 걸친 트랜스를 캡처하는 리소좀. 횡단 수용체가 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에 의해 규제되는 방법을 결정하는 데 도움이 수용체 리간드에 의해 활성화되면 세포 내 이입 동안 리소좀 또는 다른 세포 소기관이있는 횡단 수용체의 동시 인신 매매를 조사.
1A AT R 주로 HEK293 촬영 한 대부분 있지만, 모델 전지 시스템의 중앙 II로 처리 다음 리소좀 저하 될 것으로 추정된다리간드, 앙 II의 대량 리소좀 2, 3, 4, 5의 열화 상태 eptors 주로 세포막 나중에 재활용 multivesicular 재활용 엔도 좀에 편재되어있다. 최근 리튬 등. 포스터 공명 에너지 전이 (FRET) 및 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM) 기술을 이용하여 증명하는 AT 1A는 R의 colocalizes LAMP1으로 (~ 10 nm의 척도), 리셉터의 적어도 일부에 타겟팅 및 열화되는 것을 제안 리소좀 막 단백질 리소좀 (6)에 의해. 이 저자는 리소좀 억제제 클로로퀸은 클로로퀸의 효과가 리소좀 늦은 엔도 좀 또는 autophagosomes의 융합을 차단하는 것을 제안 이전 보고서와 일치 1A R-램프 1 협회에서 차단 지적했다. 기타 간접 접근 (1A)의 R 리터 AT 결정리소좀에서 ocalization는 리소좀 3, 4, 5, 6, 7, 8 (1A)의 R의 앞에서 추론 리소좀 억제제 bafilomycin 이용했다.
라이브 셀 이미징은 세포 부피 및 GFP-키메라 수용체의 손실 / 디밍 / 재배포에 고정의 잠재적 영향을 방지 할 수 있습니다. 이전 연구 colocalization을하거나 또는 리포좀 등의 수용체 - 결합 대용 표지 생균 사용에 수용체의 동시 발생을 결정 고정 세포 의존 한 β-아레스 1, 2, 3, 4, 5, 6. 회전 디스크 공 촛점 또는 레이저 포인트 스캐닝의 conf를 사용하여 다른 된 GPCR의 라이브 셀 이미징하나로 이루어질 수 또는 HYD 탐지기가 장착 OCAL 현미경은 30 초 간격으로 9, 10 Z-스택에 몇 군데 개별 세포 수용체의 내면화와 인신 매매를 관찰하는 연구자 수있었습니다. 라이브 세포 Z - 스택이 빠르게 수집 그러나 경우에도, 분석은 2D (10)에 즉 각 스택 내에서 단일 평면 선택 후 발생할 수 있습니다. 이 문제의 내재화 GPCR 또는 티로신 키나제 수용체 공부 충분할 수도 있지만, AT 1A는 루피는 시간의 크기와 위치를 변화함으로써 본질적으로 적절하게 각 시점에서 대표적인 단일 슬라이스를 이용하여 시료에 더 어렵 소체에 축적한다. 철저히 셀 통해 크기 및 위치에 다른 소포 각 모집단을 검출하는 1A의 R AT 분류의 경로를 결정하기 위해, 3 차원 영상 및 3 차원 분석을위한 방법은 이러한 변화를 추적하고되도록 고안 이러한 리소좀 등 다양한 세포 내 구획의 표시와 함께 사용.
수사관들은 직접 셀과 중앙 II 자극 다음 세포 내 구획에 그 이전에 AT 1A는 R의 움직임을 시각화하는 라이브 세포 이미징에 대해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 세포 내 구획 형광 단백질 키메라 또는 다른 형광 마커 태그. 이 프로토콜은 또한 야생형 수용체 대 비교하는 돌연변이 또는 약물 치료를 다음과 같이 변경을 검출하기 위해 200 nm의 최소 해상도 세포 내 소기관의 수용체를 지역화하는 첫 번째 방법으로 사용될 수있다. 이 라이브 셀 이미징 구비하는 공 초점 현미경에 대해 수행 될 수 있기 때문에이 기술은 액세스. 이 방법의 상대적인 용이성이 증가 전문성과 상호 작용 분자 (6)을 검출 FRET / FLIM / BRET 기술을 수행하는 데 필요한 장비와 대조"외부 참조"> 11. 이러한 측정은 높은 해상도 (~ 10 ㎚)과 세포 내 소기관 내 위치 파악이 유추됩니다에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 정의합니다. 이러한 고급 기술은 후속 또한 분자 관심 작용보다는 세포 내 구획을 통해 수용체 통로를 정의하는 데 사용되며, 이들은 직접 셀 (11) 내에서 특정 시간과 장소에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 보여준다. 화상 취득이 느리기 때문에 FLIM, 억 셉터 농도에 독립적 인 FRET 기술은 주로 고정 된 샘플들에 수행된다. 대조적으로, 비 FRET 빠른 영상과 상호 작용하는 단백질의 고해상도 colocalization을을 제공한다. 비 FRET의 단점은 이미징 위드 에피 형광 이미징 속도를 얻기 위해 감소 해상도 및 세포 기관 (12)의 대조 결과 전체 셀을 포함를 활용한다. 생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)는 다른 인시간 (11)를 통해 분자 근접의 인수를 측정하기 된 GPCR에 적용된 고급 기술. 이 기술에서, 단백질 형광 분자는 분할되고, 각 반 당해 두 단백질 중 하나에 연결. 되면 관심 바인드 두 단백질 서로 키메라 태그의 부분은 형광 시간 동안 정량 증가 형광 취득 조립 재.
여기서 우리는 중앙 II 자극과 중앙 II 자극을 다음과 리소좀에 1A의 R AT 내면화 전달의 전위 변화에 따라 셀에 AT 1A는 R의 인신 매매를 연구하는 이미지 정량화와 결합 라이브 세포 이미징을위한 간단한 방법을 제시한다. 이 기술의 궁극적 인 사용은 야생형과 돌연변이 수용체를 비교 막 인신 매매의 차이를 특성화하는 것입니다. 이러한 차이는 AT 1A는 R leadi는을의 생리 활성 메커니즘 (들)에 영향을 파악하는 데 도움이 될 것입니다혈압 조절 ng 내지.
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Protocol
첫날
1. 셀 시드
- 완전한 둘 베코의 변형 이글 중간 (DMEM)을 준비합니다. 소 태아 혈청 (10 %)으로 보충 된 완전 DMEM으로 500 mL로 DMEM 450 mL의 소 태아 혈청을 50 ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 ㎖, L- 글루타민 5 mL를 추가, 페니실린 / 스트렙토 마이신 1 % 및 L- 글루타민 (1 %).
- 종자 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 통과 번호 6-11 / 50,000에서 잘 완전한 DMEM의 8 잘 챔버의 coverglass 시스템입니다.
- 24 시간 동안 5 % CO 2와 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 챔버 슬라이드를 유지한다.
둘째 날
2. 리포좀 형질
- 갓 바이오 안전성 수준이 캐비닛과 함께 멸균 조건을 사용하여 1A의 R-GFP 플라스미드 및 리포좀 솔루션 AT합니다.
- 정광을 달성하기 위해 감소 된 혈청 미디어의 178 μL 900 NG에 플라스미드 DNA의 2 μL를 희석 / μL는 원액약 10 NG / μL의 플라스미드 DNA의 이온.
- 주식의 1시 40분 희석을 만들 수 감소, 혈청 미디어의 175.5 μL에 리포좀 원액의 4.5 μL를 희석.
- 플라스미드 용액 리포좀 용액을 첨가하고, 형질 감염 용액을 혼합하는 다운 20 회 피펫하고, 1 용액을 피펫을 이용하여 혼합한다.
- 실온 (25-27 ℃로)에서 30 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
- 이 혼합물을 배양하는 동안 1 ML의 피펫으로 천천히 용지를 제거하고 천천히 400 μL 37 ° C로 미리 예열입니다 1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 추가합니다.
- 조심스럽게 PBS를 제거하고 200 μL / 웰의 감소 혈청 미디어가 37 ℃로 미리 예열로 교체.
참고 : 인해 피펫 팅에 의해 유도 깎아 지른듯한 스트레스로 커버 슬립에서 세포의 분리를 방지하기 위해 세포를 세척 할 때 모든 단계에서주의해야합니다. - 30 분 동안 5 % CO 2 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 유지한다.
- 일단잠복기는 각 웰에 형질 전환 믹스의 80 μL를 추가하고 배양 세포를 4.0-4.5 시간 동안 만 5 % CO 2와 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 더 이상 5 이상 시간, 끝났습니다.
- 형질 감염 잠복기가 완료된 후, 천천히 한 용액을 피펫을 사용하여 챔버로부터 상기 미디어를 분리하고 부드럽게 5 % CO 2로 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 완전 DMEM 잘 300 μL / 교체 및 부화 .
셋째 날
3. 혈청 기아
- 부드럽게 1 ML의 피펫을 사용하여 미디어를 제거하고 천천히 페놀 레드없이 무 혈청 DMEM 300 μL로 교체합니다.
- 10 내지 12 시간 동안 5 % CO 2 가습 인큐베이터에서 37 ° C로 챔버를 유지한다.
하루 네
4. 라이브 셀 이미징
- 얼룩 세포 내 구획 (이 경우 리소좀).
- ABO최종 염료 농도 각 웰에 유타 30 분, 세포에서 리소좀 이미징 1 μm의 형광 염료 원액에서 22.5 μL를 추가하기 전에 (페놀 레드없이 무 혈청 DMEM의 499.5 μL에 희석 0.5 μL 1 mM의 형광 염료) 75 nM의의.
- 5 % CO 2와 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 25 ~ 30 분 동안 품어 부드럽게 염료를 제거하고 천천히 페놀 레드없이 신선한 무 혈청 DMEM의 300 μL를 추가합니다.
- 이미징을위한 현미경을 준비합니다.
- 자동화 된 현미경의 시작시 렌즈의 손상을 방지하기 위해 단계를 조정합니다.
- 현미경 전력, 스캐너 전원, 레이저 출력 한 다음 레이저 방사를 켜고, 마지막으로 육안 관찰의 메탈 할라이드 램프 (공 초점 현미경 제조업체의 지침을 참조하십시오).
- 이미징 소프트웨어 프로그램을 열고 아르곤 (488 ㎚) 레이저 전원을 켭의 소프트웨어 차례 30 ~ 50 %이다. 전원에 의존 참고레이저의 나이. 실험 내에서 일정 설정을 유지하기 위해 매우 중요합니다.
- 적색 발광 레이저를 켜십시오 (예를 들어 568 나노 미터 또는 594 ㎚).
- 12 비트 깊이로 설정 이미징 형식입니다.
- 아르곤 레이저 라인 488 nm의 및 1 에어리 디스크 장치에 568 나노 미터 또는 594 nm의 레이저 핀홀을 설정합니다. GFP의 매우 어두운 경우, 2 에어리 디스크 장치의 설정을 사용하지만, 적절하게 채널을 일치합니다.
- 다이크로 익 필터의 세트를 사용할 때, GFP 형광 염료에 해당하는 발광 파장을 선택한다. 적색 발광 형광 염료에 대한 680 nm의 - 또는, 499-580 GFP를위한 나노 및 엠 599에 발광 파장 (엠)을 설정합니다.
- 그 통해 피와 크로스 오버가 발생하지 않습니다 확인합니다. 차례로 각각의 레이저를 끄고 각각에 대해 모두 방출 채널을 선택합니다. 아르곤 레이저가 꺼져있을 때, 녹색 발광이 0이되어야합니다. 녹색 발광 레이저가 꺼져있을 때 적색 발광 채널은 0이되어야합니다.
참고 : 가장 안전한 방법은 별도의 트랙에 각각 (sequ 이미지입니다ential). - 원하는 경우 시야 채널을 포함합니다. 이 colocalization을 측정을 왜곡 할 수 있기 때문에 차동 대비 영상 (DIC)을 피하십시오.
- 라이브 영상, 선택 선 순차적이 아닌 프레임 순차하십시오.
- 이미지를 선택 세포.
- 이러한 63X / 1.4 NA 오일 화상 세포 대물 (또는 40X / 1.4 NA)로서, 1.4 개구 수 (NA) 목적을 이용한다. 목표를 중심과 목적에 점도가 높은, 낮은 자기 형광 침지 기름 한 방울을 추가합니다.
- 현미경의 단계로 인큐베이터에서 형질 세포와 챔버를 전송합니다. 평면 슬라이드를 유지하고 챔버가 잘 장착 및 이동 억제되는 것을 보장하기 위해주의해야합니다.
- 기름의 드롭 그냥 슬라이드의 바닥에 닿을 때까지 목표를 위로 이동; 오른쪽 초점면이 위치 근처입니다. 자동 현미경,이 위치뿐만 아니라, REM 사용할 하강 위치를 저장촬상 실험 ainder 샘플 변화 촉진한다.
- 어두운 셀을 선택합니다. 1A R-GFP AT 과발현하는 세포가 세포의 수용체를 잘못 지시 정상적인 기능을 방해한다.
- 플라즈마 막에 의해 정의되는 셀의 윤곽이 보이는 바람직 다른 셀과 겹치지 않는 것을 확인한다.
- 초점 시야에서 셀 중앙.
- 공 초점 모드로 전환합니다.
- 빠른 영상 모드를 선택합니다. 하나의 초점 제어에 손과 무대 XY 컨트롤의 다른으로 집중하고 모니터에 가시화 관심있는 셀을 중심으로.
- 셀을 통해 아래로 집중에 의해 관심의 세포가 잘 확산되고 그 아래 또는 복부 측면이 커버 슬립과 긴밀하게 병치 있는지 확인합니다.
- 이미지는 z-단계 매개 변수를 3D로 셀을 설정합니다.
- 는 Z - 스택의 상단과 하단 대화 상자 (또는 동급)의 전원 버튼을 선택하고 C의 바닥에 초점엘 다음 "시작"키를 누릅니다. 그런 다음, 셀과 언론의 정상에 초점 "끝." 전체 셀이 Z 스택에 포함된다는 것을 재확인.
- 1.0 μm의에 Z-단계의 크기를 설정합니다.
- 설정 이미지 설정.
- 최종 픽셀 크기는 X 0.279 μm의 0.14 μm의 XY 차원의 X 0.14 μm의 약 0.279 μm의되도록, 렌즈에 따라 확대 2 선택합니다.
- 이 실험에서 HEK 세포의 경우 세포의 밝기에 따라, 복셀 당 약 1 μS에 스캔 속도를 설정하고이 평균 또는 라인으로 2 축적을 선택합니다.
- 레이저 강도를 조정하고 GFP 형광 염료를 이미징 얻을 수 있습니다. 일반적으로 대조 염색 따라서 광전자 배증 검출기 (PMT) 및 GASP 및 HYD 검출기는 GFP 채널에 필요한 반면하지 갈륨 비소 인화물이 (하나로 이루어질) 또는 하이브리드 검출기 (HYD)가이 제 2 색 채널에 대해 이용되어야 더 밝을 것이다. HYD 또는 하나로 이루어질 감지하는 경우ORS주의를 발휘하고 매우 낮은 전력에서 레이저로 시작, 형광 염료에 사용됩니다.
- 스캔과 스캔 주파수의 설정 기간은, 예를 들어, 모든 30 ~ 60의 25 분 이상은 리소좀에 AT의 1A R-GFP의 대상으로 볼 수 있습니다.
- 시간이 지남에 초점면의 안정성을 유지하기 위해 자동 초점을 설정합니다.
- 이미징 실험을 시작합니다.
- 5 μg의 / μL (4.7793 밀리미터)에서 사전에 100 배의 중앙에 II 재고를 준비하고 998 μL 매체 (10 μM)이 2.1 μL를 추가합니다.
- 직전 영상 (최종 농도 100 ㎚)에 함유 웰에 300 μL의 리간드 (ANG II)의 100X 원액 3 μL 첨가하여 리간드 자극을 시작한다.
- 원하는 시간 및 주파수 차원에서 시작과 이미지를 클릭하십시오.
- 현미경에서 작업을 마무리하기 전에, 분석하는 동안 배경 공제에서 나중에 사용하기 위해 Z - 스택을 수집합니다. 광자 개수 모드에서는이 아니다배경이 있기 때문에 필요한 본질적으로 0 조명이 켜져 있고 다른 모든 촬영 조건 같은, 그러나 어떤 샘플 샘플 이미지를 촬영합니다. 분석중인 배경 빼기 (아래)를 참조하십시오.
하루 다섯
5. 이미지 분석
- TIFF 형식으로 내보내기 이미지.
- 마우스 오른쪽 메뉴를 참조하고 내보내기를 선택하거나 파일을 클릭하여 이미지 파일 이름을 클릭 | 수출 | 수입.
- 원시, 12 비트 데이터 [이 아닌 '레드 블루 그린'출판 품질의 이미지 사용 (RGB) 변환]을 내보낼 확인하는 후속 분석을위한 티파니로 내보내기. JPEG 형식으로 내보낼하지 마십시오.
- 는 X, Y, Z의 복셀 사이즈 및 이미지 분석에서 나중에 사용하기 위해, Z 스텝의 사이즈를 참고. 예를 들어, 40X / 1.4을 사용. NA 대물 렌즈 이러한 값은 X 0.138 μm의 1 μm의와 Z-스텝 크기 (대표 결과 섹션의 데이터를 참조) 0.138 μm의 수 있습니다.
- <강한> 분석을위한 이미지 스택을 만듭니다.
- 이미지 열기 정량 소프트웨어 (그림 2)
- 수입 하나의 시퀀스 (그림 2, 화살표 # 1)에서 하나의 파일 이미지를 생성하기 위해 "선택된 시퀀스에서 이미지 | | 새로 만들기 조치"를 사용합니다.
- 채널의 수 (Z) - 부분 수, 시점의 개수를 입력한다.
- 화상면의 순서로 예를 들어, 선택 * .TIFF 파일의 구조에 따라, 채널 Z 평면 및 시점. 최종 화상 스택 정확하게 원래 이미지의 컬러 채널 Z 스택 및 시점을 나타내는 것을 확인한다.
- 이미지 이름을 선택합니다 (그림 2, 왼쪽에 파일 이름을 강조 표시는 화살표 # 2). 오른쪽 이미지 및 / 또는 이미지 필드를 클릭하고 목록의 맨 아래에있는 옵션에서 "속성"을 선택합니다. (X) (Y) 및 (Z)의 크기에 μm의 화소에서 올바른 이미지 속성은 전술 한 바와 입력한다.
- 이전 이미지 분석을 빼기 배경입니다. 백그라운드 보정은 화상 해석 소프트웨어로 달성 될 수있다. 두 가지 옵션 중 하나를 사용하여 빼기 배경입니다.
- 옵션 1 : 선택 "액션 | 새로 만들기 | 배경 빼기"(그림 2, 화살표 # 1). "| 배경 빼기 도구"에서 "어두운 참조"화상으로서 상술 한 촬상 세션의 마지막에서 얻어진 획득 배경 이미지를 사용한다.
- 옵션 2 : 어떤 샘플이없는 이미지의 가장 어두운 영역을 검사하여 가짜 형광, 임의로 밝은 픽셀, 또는 다른 현상이 될 수있는 비정상적으로 밝은 픽셀을 무시하고, 그 지역의 픽셀의 평균 또는 최대 밝기를 찾을 수 있습니다. 선택 "작업 | 배경 빼기 | 새로 만들기"를. 오프셋으로 (음수)이 픽셀의 밝기를 사용합니다.
- 색상 등록을 확인하고 필요한 경우 올바른.
- 선택하여 등록 보정을 생성 "액션 | 새로 만들기 | 등록 수정"(그림 2, 화살표 # 1) 조정 작업을 할 수 대화 상자를 사용합니다. 완료되면 새 폴더 항목은 "등록 정정을"이라는 제목이 나타납니다.
- (동작 인접 툴 버튼) | 이미지 이름을 클릭하여 관심있는 하나 이상의 이미지에 대한 등록을 신청 (도 2, 왼쪽 파일명을 강조 # 2의 화살표) 다음 선택 "올바른 등록 도구".
- 이미지를 선택합니다 (그림 2, 왼쪽에 파일 이름을 강조 # 2 화살표) 자유형 영역 도구 (그림 2, 3 화살표 #)를 사용하여 단일 세포 주위의 관심 (ROI) 및 그릴 영역을. (2D 왼쪽 상단 드롭 다운 메뉴) 확장 초점 모드를 사용 자르기 도구는 2D 시각화 작품으로 세포를 관찰 할 수 있습니다.
- 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "선택에 자르기"를 선택하고 새로운 이미지 항목이 생성됩니다.
- 이름을 클릭하여 자른 셀을 선택하고 위의 "측정"탭을 선택합니다 (그림 2, # 화살표 4).
- 정의하고 GFP에 대한 내면화 소포를 측정, 드래그 "찾기"순서 상자에 (그림 2, 화살표 # 5) (그림 2, 6 화살표 #)에서 "개체 찾기"를합니다.
- GFP의 채널에 채널 "개체 찾기"를 설정합니다.
- 오픈 설정 (대화 상자의 바퀴 아이콘, 화살표 # 6) 및 설정4, 사용 임계 값 : "SD에"0 μm의 3 최소 개체 크기 ","6.에 "하한.
주 : SD 하한은 각각의 실험에 따라 달라집니다. 올바른 개체가 서로 다른 시간 점 (그림 2, 7 화살표 #)를 검사하여 역치 구성되어있다 시각적 확인. 은 "측정 | 피드백 옵션"대화 상자 (그림 2 화살표 # 8) 역치 개체를 시각화 선택한 방법을 선택하는 데 사용됩니다. - "개체 찾기"대화 상자에서 "측정"을 클릭합니다 (그림 2 화살표 # 6) 및 측정 채널과 유형을 선택합니다. 일반적으로, "모든 채널"및 "강도 및 볼륨 측정"을 선택합니다.
- 2 μ에 SD 0 "최소 개체 크기를"다음 매개 변수를 사용하여 - 단계 (5.5.8 5.5.4) 이상 반복, 전체 셀의 식별을 위해 임계 값과 필터를 정의하려면 총 GFP 강도를 측정하기 위해두 번째 "개체 찾기"대화 상자에서 m 3 (9 화살표 #을 그림 2) GFP를 사용하여 세포를 식별하는
- 인구 2 아래의 순서 상자에 "필터링"에서 드래그 "필터 인구"(두 번째 "개체 찾기"상자, 그림 2, 화살표 # 9). 선택 "볼륨 (μm의> 100 3).
- 시각적으로 하나의 개체가 식별되어 있는지 확인합니다. 전체 셀 임계 된해야하고 다른 모든 객체 얻어 여과 하였다. 셀은 예를 들어, 작 으면 "필터"매개 변수 (들)을 조절할 필요가있다.
- 측정이 표준화되면, ( "프로토콜 복원") 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 프로토콜을 저장하고 재사용하기 위해 "저장 프로토콜"을 선택합니다. 이 프로토콜은 또한 이미지와 같은 하위 디렉토리에 기록을 제공하기 위해 내보낼 수 있습니다.
- 선택하여 "측정하기 '로 진행"측정 | 측정 항목 만들기 "(그림 2
- 정확한 측정 이름을 입력합니다 (이미지에서 붙여 넣기를 복사하면 편리하다) 및 분석 코드 또는 날짜 (기록 보관을위한 유용한 추가) 및 "모든 시점들"을 선택합니다. 새 워크 시트 항목은 이미지 아래에 작성됩니다. 간결한 파일 이름을 유지합니다.
- 워크 시트 파일 이름을 클릭하고 "분석"탭을 선택합니다. 포화 복셀은 "에 대한 분석을 제한 :"첫 번째 선택에 의해 존재하는지 확인 인구 2 (셀)을 선택합니다.
- 오른쪽 "분석 탭"에서와 "이러한 데이터를 분석 :"아래의 대화 상자에서 필드를 클릭 "최대 ([GFP 색상 채널])"을 선택; "로 요약"에서 "평균 ([GFP 색상 채널을]"를 선택하고, 아래의 "하여 데이터를 정리 :"와 "줄" "평가시기"및 CLI를 선택CK "OK".
참고 : 데이터가 포화 픽셀 (12 비트 16 비트 또는 4,096 예 : 65536)를 포함하는 경우, 분석이 (가 소포의 내용을 과소 평가한다)이 정확하지 않습니다. 분석을 위해 해당 셀을 무시하십시오. 포화하지 않으면 다음 단계로 진행합니다. - 다음으로, "원시"탭에서 다음 "분석"탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 데이터를 찾을 수 "에 분석을 제한"에서 다음 전체 셀 소포 또는 인구 2 인구 1을 선택합니다.
- 아래 것은 "이러한 데이터를 분석"(GFP 색상 채널) "합"을 선택; 아래는 "으로 요약 :" "합"을 선택; 와 "행"은 "평가시기"를 선택하거나 "상대 시간"하고 "확인"을 클릭하고, 아래의 "하여 데이터를 구성합니다." 분석 선택을 저장하고 재사용 할 수있다.
- 선택 및 복사 / 빈 스프레드 시트에 이미지 정량 소프트웨어에서 직접 붙여 넣기 또는 저것을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 스프레드 시트 데이터를 내보낼.CSV 파일로 저장 a와 선택. 전체 셀 강도 측정은 그렇게 확인하고 소포에서 분리해야 인구의 각 소포의 측정에 포함됩니다.
주 : 데이터를 플로팅 한 후, 소포에 포함 된 총 GFP 형광의 증가가 급격하게 상승한다. 이 발생할 경우 광표백, 시간이 지남에 따라 전체 셀 GFP 강도의 감소로서 검출된다.
- SD와 "하한"에 : 설정 찾기 개체 (인구 1)에서 적색 채널 및 휠 (6) (그림 2) 세트 "임계 값 사용"화살표 번호로 표시하는 대화 상자에서 아이콘에 채널 "개체 찾기" 0.017 μm의 3 6. "최소 개체 크기".
주 : SD 하한은 각각의 실험에 따라 달라집니다. 올바른 객체 시험에 의해 이루어져야 임계 된되는 시각적 확인ining 다른 시점. 은 "측정 | 피드백 옵션"대화 상자 (그림 2 화살표 # 8) 역치 개체를 시각화 선택한 방법을 선택하는 데 사용됩니다. - 개체 "찾기"를에 "측정"을 클릭하십시오 "대화 상자 (그림 2 화살표 # 6) 및 측정 채널 및 유형을 선택합니다. 일반적으로,"모든 채널 "및"강도 및 볼륨 측정 "선택됩니다.
- 인구이 들어 것과 동일한 설정을 사용 1A R-GFP (5.5.9) AT 발현하는 형질 전체 셀을 식별하기 위해 사용된다.
- (형광 색소 양 소포로 형질 감염되지 않은 세포를 포함한) 복수의 셀이있는 경우, 분석의 첫 단계에서 셀 자르기 중요하다. 다르게는, "구획"의 사용은 R-1A AT GFP 발현하는 형질 감염된 세포 내의 리소좀의 식별을 제한하는 데 사용되어야한다. 리소좀 만 GFP 세포 내에서 확인할 수 있어야하며하지 근처에 형질 감염되지 않은 세포.
- 위와 같이 분석하고 데이터 내보내기.
주 : 임계 된 세포 소낭의 일례가도 4에 도시되어있다.
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Representative Results
이 실험의 대표 세트에, HEK 세포를 N2 및 pEGFP-13 플라스미드로 클로닝 (1A R-GFP AT) 안지오텐신 계 1A 수용체 구성 (E1,2,3-AT 1A는 R)로 형질 감염시켰다. HEK의 시간 경과 이미지 획득 및 동영상 (라이브 셀 이미징 1 라이브 셀 이미징이 동영상 참조)로 연주 하였다. 영화와 스틸 리간드 자극 후 1A AT R-EGFPs는 세포막에 주로 국부 것을 보여 주지만, 중앙 II 첨가 밝은 소체를 형성하는 2.5 분 내에 내부화 될 이들 수용체와 나중에 시간이 크다 소체에 클러스터링 핵 주변 영역 (도 4B, 5, 6A, 라이브 셀 이미징 2).
그림 5 페이지에있는 셀에 대한 총 세포 GFP 강도와 총 소포 GFP 강도의 정량화중앙 II는 파동 운동을 유도하고 세포 모양 변경 사항이 즉시 자극 다음과 같은 경우에 내재 된 합병증의 그림 rovide (그림 5A, 0 분 후 중앙 II에서 화살표를, 상단 행, 오렌지 역치 개체를 나타냅니다). 나중에 시간에서, 핵 주변 클러스터의 GFP 함유 소포의 현지화도 (29.5 분에서도 5a, 빨간색 화살표)을 방해한다. 모든 개체는 전체 셀 GFP 강도 측정에 포함되어야 비록 그들이 1A R-GFP AT 세포막을 나타내는 바와 같이, 주름이 소포 측정에서 제외한다. 반면, 클러스터 된 핵 주변 소포는 (, 후자는도 5a에서 빨간색 원에 포함 된 셀의 영역에서 볼 수 있습니다 29.5 분에서 후 중앙 II, 아래 줄을 화살표) 소포 측정에서 제외되어서는 안된다. 크기 필터링하여이 작업을 수행하기 위해 시도가 주름 및 클러스터 절 차별하지 수 있기 때문에 유용하지 않았다 (이상 또는 이하 7 μm의 3 이상)esicles (도 5a 및도 5b는, 필터> 7 비교할 <7 필터 및 필터 없음). 가능한 대안은 세포의 세포질 부분을 포괄하지만 셀의 파동 운동 가장자리 둘레를 제외 관심 (ROI)의 영역을 그릴 것입니다. GFP 존재하는 픽셀이 포화 되었기 때문에 결국,이 셀은 정량적 결과에 포함되지 않는다.
두 번째 대표적인 예는 오토 포커스 기능을 사용하지 않는 한에서 시간 경과를 나타내는도 6a에 도시되어있다. 내재화 GFP는 %의 총 세포 GFP (그림 6B)로 표시됩니다. 이전의 3 분의 빨간 화살표의 시점은 상기 셀의 일부로서 만 오해되는 것은 촬상 공간으로했지만 중앙 II를 첨가 한 후 3 분은 초점면이 다시 안정. 세포 내 총 GFP이 셀 (도 6c 시간 동안 상당히 photobleach하지 않았 음을 보여 ). 소포의 다음 증가 수준 오프 (그림 6B)에서, %의 GFP 강도 3 년 사이 약 12 분. 이어서, 형광 색소로 식별 리소좀는 GFP 강도 (도 6D)의 합계에 대한 정량화 된 형질 감염된 세포 내에서의 ROI를 식별하기 위해 사용되었다. 3 분 후에, 빨간색 확인 된 리소좀에서 AT의 1A R-GFP의 강도는 시간이 지남에 따라 (그림 3D, N = 5, 평균의 ± 표준 오차를 의미) 변화하지 않습니다. 따라서 중앙 II 투여 후 최대 24 분 동안 리소좀에 AT의 1A R-GFPs의 전달에는 검출 증가는 없다.
그림 1 : 조회 테이블 (LUT)에서 확인 된 포화 픽셀. 빨간색 화살표가 파란색으로 표시 포화 픽셀을 나타냅니다.t = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 이미지의 정량화 소프트웨어의 개요. 주요 항목은 숫자로 표시 및 방법 텍스트 내에서 논의된다. 1) 작업 항목, 2) 선택된 이미지, 3) 자유 손 ROI 툴, 4) 측정 탭, 5) 개체 찾기, 6) 인구 1 찾기 개체 대화 상자 7) 화살표가 활성화 시간 경과 영화, 8) 측정 항목, 9) 두 번째 찾기는 필터 인구 명령을 포함하는 대화 상자 개체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 색상 등록 수정. 보정과 이미지수정 화소 등록은 1A의 R-GFP AT 포함하는 여러 colocalizing 소포의 세트와 함께 표시됩니다. 적색 픽셀은 보정되지 않은 화상의 XY 평면 내의 좌측으로 한 픽셀 시프트된다. 세트는 높은 배율에서 박스 영역을 보여줍니다. 스케일 바 = 3.3 μm의, 복셀 크기 = 0.138 X 0.138 × 1 μm의 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 임계 화의 그림 GFP- 및 형광 염료 함유 소포 및 GFP-전체 세포를 식별합니다. (A) (1A)의 R-GFP (GFP, 맨 윗줄) AT 사용하여 전체 세포의 식별 및 전체 셀 (ID 전지, 아래 행) 0에 표시 2.5 분 중앙 II 첨가 후 있습니다에 대한 GFP를 임계 된. 화이트 박스 기능을 표시(B) 및 (C)에 도시 외 영역. 1A R-GFPs AT (B)는 단일 컬러 이미지의 중앙 II 추가 (맨 윗줄) 후 0, 2, 5 분에 비교된다. 임계 값에 의해 식별 소포는 맨 아래 행 (ID 보이는 군, 보라색)에 표시됩니다. (C) (1A의 R-GFP / 형광 염료 AT) 2 색 이미지는 0과 2.5 분 후 중앙 II뿐만 아니라에 표시됩니다. 임계 값에 의해 식별 리소좀은 빨간색 윤곽선으로 표시됩니다. 스케일 바 = 7.0 μm의, 복셀 크기 = 0.114 X 0.114 X 1.4 μm의 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 내면화 GFP 수용체의 측정에 프릴과 클러스터 된 소포의 효과의 그림입니다. (A) 중앙 II에서 T 1A는 R-GFP 0 (맨 윗줄) 2.5 분 (아랫 줄)을에, 첫 번째 열에 필터보다 큰 7 μm의 3 만 선택 객체에 적용된 세 가지 필터링 실험에 도시에서 세포 치료 선택 두 번째 열은 7 μm의 3 이하 개체, 세 번째 열에서 어떤 필터는 사용되지 않았다. 임계 수준은 세 가지 일정이었다. 화살표는 원 이후 시점에서 핵 주위 소포를 포함하는 세포질 영역을 나타내는 큰 역치 개체를 나타낸다. 역치 지역은 오렌지입니다. 소포에서 GFP 총 강도 (B) 정량 또는 (A의 행에 의해)이 시점에서 (A에 열을 기준으로) 크기 필터링없이 역치 영역에 대한 표시됩니다. 복셀의 크기는 X 0.138 × 1 μm의 3 0.138이었다. 스케일 바 = 5.6 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 리소좀에서 AT1 R-GFP 국제화 및 잠재적 인 현지화를 추적. (A) LysoTracker 빨강 AT의 1A R-GFP 다섯 선택된 시점 0, 3, 6, 9, 12 분 후 중앙 II에 첨부 된 영화 (생균 촬영 한 동영상)에서 도시된다. 그리드 6.56 μm의 3의 단위 크기를 나타내고, 복셀의 크기는 0.297 X 0.297 X 1.2 ㎛의 (3) 및, Z = 1.2 μm의 단계였다. (B) 시간이 지남에 소포의 퍼센트 총 GFP의 줄거리는 AT의 1A R-GFP의 급속한 국제화를 보여줍니다. (C) 시간에 따라 셀의 전체 GFP의 플롯은 비교적 작은 광표백 이미징 24 분 동안 발생한 것을 나타낸다. (D) 리소좀은 LysoTracker 레드 양성 소포를 식별하여 확인되었다. 플로리다에서 총 GFP 강도uorescent 색소 양 소포의 ROI는 (독립적으로 측정되지 광표백 없음 보상 제 시점 정규화) 각각의 시점에서 측정했다. (C - D) 화살표에 앞서, 측정 포커스 시프트 때문에 유효하지 않다. N = 5, 평균의 표준 오차 ± 평균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : 라이브 셀 이미징 1 : (오른쪽 다운로드 클릭) 100 nm의 중앙 II의 추가 후 24 분 (25 프레임)마다 1 분을 이미지화 된 AT의 1A R-GFP로 형질 HEK 세포를. 영화는 계획-Apochrom와 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 인수 한63X / 1.4 NA 오일 목적에서, 0.279 X 0.279 X 1.2 μm의 3의 복셀 크기; 및 3.20 μS / 픽셀에서 몇 군데 4.794 μm의 두께 총 5 조각. 동영상 속도는 2 프레임 / 초이다. 단위 = 6.56 μm의.
영화 2 : 라이브 셀 이미징 2 : (오른쪽 다운로드 클릭) 100 nm의 중앙 II의 추가 후 25 분 (51 프레임)마다 30 초를 이미지화 한 AT의 1A R-GFP로 형질 HEK 세포를. 영화는 계획 - 고차 색지움 40X / 1.4 NA 오일 목적으로 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 획득 하였다. 복셀의 크기는 X 0.11 X 1.4 μm의 3 0.11이었다. 8.4 μm의 두께 총 7 조각은 3.72 S / 프레임에 몇 군데 있었다. 동영상 속도는 3 프레임 / 초이다. 스케일 바 = 7 μm의.
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Discussion
여기에 제시된 예비 실험은 24 분의 비교적 짧은 시간 과정 동안, 리소좀에 AT의 1A R-GFP의 전달에는 상당한 변화가 발생하지 않았 음을 보여줍니다. 일반적으로 리소좀에 내면화 수용체의 전달은 빠르면 15 ~ 20 분으로 발생할 수 있습니다. 이 실험은 1A의 R AT 내면화의 대부분이 큰, 핵 주변 엔도 좀을 대상으로 가설과 일치한다. R은 리소좀에 도착 1A AT 적어도 일부는 리 등에 의해 입증되었다 증거. , 중앙 II 처리 후 5 분 및 30 분에서 세포를 비교하여 30 AT 1A는 R과 램프 1 상당한 colocalization을 발견하지만 5 분 6 사람들.
이 논문은 세포 준비, 이미징 및 분석 단계에 대한 자세한 설명을 제공하고이 고급 이미징 기술에 많은 고유의 함정에 대해 설명합니다. 이 방법은 아래에서 설명 중요한 단계에 따라 달라집니다.
세포의 건강 모든 살아있는 세포 이미징 실험에 중요하기 때문에, 때문에 성장 속도 및 높은 통로에서 형질 전환 효율의 변화의 통로 (11)를 넘어 세포를 사용하지 않는 것이 중요하다. 리포좀 용액 증가 막에 blebbing 입증 세포에 독성이 있기 때문에 전체 실험 건강한 세포를 유지하기 위해 세포 형질 믹스 잠복기 5 시간을 초과하지 않아야한다. 온도, 습도 및 CO 2 제어 전뿐만 아니라 촬상시 중요하다. 촬영하는 동안 온도 드리프트는 상대적으로 주요 Z-섹션 감도와 초점면 안정성의 손실이 발생할 수 있습니다. 따라서 별도의주의 초점면 정확하게 유지되도록 이미징 동안 세포에 중앙 II의 첨가시 권장합니다.
영상
고정 된 세포를 사용하여 면역 세포를 통해 라이브 영상의 장점은생체 내 조건은 면밀히 조절 될 수 있고, 고정 세포와 관련된 이슈를 회피 할 수있다. 그러나, 라이브 세포 이미징은 수용체 내재화처럼, 매우 빠른있는 세포 과정을 최적화하기 어려울 수 있습니다. 악기 속도 한계를 연구 할 수있는 이벤트의 선택 photobleaching에 방지 할 필요가있다. 각 영상의 실험은 다른 사람의 일부 매개 변수와 타협에 만들어 질 어떤 선택을 요구할 수 있습니다; 예로는 분석 양질의 데이터를 얻는 동시에 오버 샘플링을 피하기 위해 화소 크기, 광고의 축적, 줌 배율 및 주사 속도의 선택. 이러한 요소의 중요한 결정 적절한 화소 개별 소체를 구별하는 크기와 발생하는 이벤트의 충분한 시간 해상도를 얻기위한 요구를 얻기위한 필요성의 균형에 의존한다. 따라서 약간의 절충은 세포가 GFP 표지 수용체를 내면화하기 시작 신속하게 정보를 획득하기 위해해야합니다. 우리의현대 촛점 소프트웨어 최적의 픽셀 크기를 제안 할 수 있지만 경우에, 실험은 나이 퀴 스트 수학 식 14에 따른 최적의 픽셀 크기보다 작은 값을 사용 하였다. 다른 실험에 대한 설정의 최적 선택은 더 큰 픽셀 크기가 더 광자를 수집하는 데 시간이 더 복셀 체류 시간과 무역을 허용하는 광자의 빠른 축적을 가능하게하기 때문에 세포가 얼마나 밝은에 따라 달라집니다.
분석이 성공하려면, 라이브 세포 이미징은 비판적으로 시간 경과 이미징 동안 정확한 초점 안정화가 필요합니다. 이미지에 초점 이동과 실패는 전체 세포 수용체 내재화의 정량에 따라 지대한 영향뿐만 아니라 전체 휴대 GFP 강도를 가질 수 있습니다. 중앙 II를 첨가 한 다음 영상의 빠른 시점 동안 초점의 이동이 문제의 해결책은 오토 포커스 용액의 형태로 촛점 제조업체가 제공되어있다 커버 슬립의 interferom자동 초점 제어 피드백과 함께 적외선 레이저 etry는 IR 반사에 의해 식별 된 커버 슬립 표면 대물로부터의 상대적인 거리를 유지하기 위해 사용된다 (예를 정한 포커스 또는 포커스 적응 제어). microscopist의 나머지 문제는 형상의 변화에도 불구하고, 전체 셀은 촬상 공간에 유지되도록 올바른 Z 범위를 식별 한 후이다. 온도 중앙 II의 첨가 후 초기 시점 동안 포커스 / Z 위치를 유지하는 또 다른 중요한 인자이다. 목적의 온도뿐만 아니라, 생균 촬상 챔버 실험 내내 37 ℃로 유지되어야한다.
영상의 또 다른 중요한 요소는 정량적으로 이미지를 획득한다. HYD 검출기가 광자 개수 모드에서 사용되는 경우 그 광자 연쇄 충돌이 발생하지 않도록, 촬상 파라미터를 설정해야한다. 의 PMT 및 기타 감지기를 들어, 이미지가 포화 픽셀 (복셀)를 포함 할 수 없습니다. 두 경우 모두에서, SPE룩업 테이블 (LUT)은 그들이 존재하는 경우 포화 화소 물론 존재를 가시화하는 데 사용될 수 cialized 상기 microscopist 레이저 강도 및 / 또는 이득을 감소시켜야한다.
분석
여기서 설명하는 접근법은 AT 1A는 R 수용체 리소좀과의 colocalization을 적용하고 있지만, 다양한 형광 태그로 표지 된 세포 내 구획에서 수용체의 상대적인 양이 질문에 인 실험에 적용 할 수있다. 목표는 다음 소기관 마커로 피어슨 colocalization을 계수를 이용하여 상기 소기관으로 여부 수용체 움직임을 측정하는 경우에 문제가된다. 계수들 중 하나는 항상 100 %에 가까운 것되도록 소기관 식별되는 모든 픽셀 마커의 많은 양을 가질 것이다. 따라서, colocalization을 측정 오해의 소지가있을 수 있습니다. 한편, 에르 총량 대 소기관에 수용체의 비율을 측정토르는 훨씬 더 유익하고 해석 명확하다. 단백질 colocalization을 가장 피어슨의 상관 계수를 이용하여 설명 될 수있는 경우에, 그 상호 작용을 더 정교한 colocalization을 방식, 즉 FLIM / FRET (6)이라도보고되었다 (1A)의 R 수용체 LAMP1 AT 것이다.
3D 영상의 사용으로 인해 시간 경과 (라이브 영상이 동영상) 중에 불가피 셀룰러 이동의 2 차원 분석 세포의 대표적인 슬라이스를 사용하는 것보다 더 정확하다. 이도에 도시 된 라이브 셀 이미지로부터 명백한 3 수용체는 주로 그 막 작은 밝은 장소에 편재 중앙 II 노출 몇 분 이내에, 그러나, 세포막에서 지역화 4b 및도 5A 막에 인접, 아마 코팅 피트 초기 엔도 좀 (도 4B를 소포 4C). 시간이 계속 진행으로, 소포는 (5A, 1도, MVEs) multivesicular 엔도 좀 설명 된 핵에 인접한 큰 소포에 3, 15 축적 셀을 통해 이동합니다. 슬라이스가 초기 시간에 세포 표면, 나중에 시간에 MVEs 포함되지 않은 경우 특히 국제화 과정을 왜곡하고 진정한 사건을 잘못 할 시간이 지남에 따라 세포를 통해 한 조각.
이 연구에서, 이미지 분석을위한 방법은 두 가지 정량적 결과에 GFP의 광표백뿐만 아니라 형광 염료의 효과를 최소화 할 수있다. 셀 (제한된 범위이기는하지만) photobleach 같이, 셀 전체 강도에 대하여 내재화 소포의 상대 휘도 광표백 가정하면 균일하게 발생하게 유지된다. 형광 염료 긍정적 인 소포는 쉽게 표준 deviatio을 선택하여 식별밝은 내면화 소포를 임계 화에 대한 평균 형광 강도 옵션 없음. 이 경우에도 형광 감소의 전체 수준과 같은 배경에서 그들을 구별한다. 따라서, 우리의 측정은 겸손 광표백의 영향에 민감하지 않았다. 그러나 시간이 지남에 따라 세포 강도의 강한 광표백과 같은 50 %의 손실을 정량적 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 대안 적으로, 광표백 효과는 대조 실험은 AT의 1A R-GFP의 경우에 형광 염료의 경우는 인접하는 형질 감염되지 않은 세포에서 중앙 II 무채색 독립적으로 측정 될 수있다. 광표백의 효과는 분석 과정에서 고려 될 수있다.
추가 우려
최근, 세포 생물 학자들은 단백질 무관 무관 형광 단백질 자체에 의해 생성 된 아티팩트를 피하기 위해 세포에서 막 인신 매매 모니터링을위한 형광 단백질의 중요한 평가 및 수정을 실시했다g는 태그. 각종 형광 단백질 로컬 미세 단백질 침전 선도 또는 pKa가 년대 아미노산 시스테인의 존재 하에서 각각 16 계 가교제와의 상호 작용에 취약하다. 이러한 상호 작용의 또 다른 결과는 형광 (16)의 손실을 포함 할 수있다. 이 유물은 모두 인신 매매의 정량적 측정에 영향을 미친다. Constantini 등은. 잠재적 인 아티팩트 (16)를 제거하기 위해 시스테인이 결여 이미징 단량체 형광 단백질을 생성했다. 따라서, 모노머에 (아닌 모노머)로부터 EGFP 스위칭 이미징 실험의 목표에 따라 시스테인이없는 형태의 산성 및 / 또는 환원 소포 미세 환경의 연구에 유리할 것이다. 또 다른 예는 FRAP에 대한 자신의 향상 유틸리티이거나 멀티 머화 및 가교 단백질 확산 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미칠 것이다 실험을 FRET 것이다.
또 다른 잠재적 인 이슈는 GFP 융합 단백질과 함께 LysoTracker 레드를 사용하여 리소좀 이미징 때 LysoTracker 레드 그린 (17)에 광 변환 할 수있는 것으로 나타났다 것입니다 고려. 저자는 표면 형광 조명의 사용을 최소화하는 것이,이 이슈의 발생을 논의하고,이 시약을 사용하여 colocalization을 성공적으로 인스턴스를 참조하시기 바랍니다. 또한, 리소좀 다른 마커 colocalization을 같은 결과를 검증하기 위하여 이용 될 수있다, 예를 들어, 6 LAMP1 태그.
미래에,이 분석의 민감도 및 특이도는 18 저하하지만 축적 7을 차단 bafilomycin 사용 리소좀 산성화를 저해함으로써 수용체 소낭 수송 및 / 또는 융합 억제제를 사용하여 리소좀뿐만 아니라 다른 세포 내 구획 대상을 조사 할 수있다 결과적 같은 리소좀 (2)에 표시된 중앙 II의 타겟팅을 양성 대조군으로 사용하여, 리소좀 2, 5, 6, 7, 18 수용체 공동 지역화 차단 리소좀과 융합을 차단하는 클로로퀸을 사용하여, 그리고 서로에 비교하여 잘 이러한 트랜스페린 또는 표피 성장 인자 수용체와 그들의 동족 3과 -described 수용체 리간드 시스템. 흥미로운 양성 대조군하는lbeit artefactual, 우리의 실험에서 1A의 R-GFP 음성 세포 AT, 형질 감염되지 않은 인접한 관찰 한 결과였다. 이 세포는 분명히 형질 감염된 세포에서 방출 GFP를했다 및 형광 염료와 colocalization을 아주 눈에 띄는했다 리소좀에 대상 (도시하지 않음). 예상대로이 colocalization을하지만, 중앙 II에 민감하지 않았다.
결론적으로 여기에 제시된 형질 이미징 및 이미지 분석을위한 방법은 여러 가지 세포 내 구획 수용체 내재화 정량적 시간 동안 살아있는 세포 내에서 추적 될 수있는 수단을 제공한다. 다른 수용체 또는 선택적으로 돌연변이 수용체 사이의 상대 비교는 특정 구획에 대한 반응 속도에 관해서 및 세포 내 현지화로 가능하다. 가능한 어려움이 기술과 관련된 이슈가 논의된다. 그럼에도 불구하고, 이미지 분석과 함께 3 차원 고속 실시간 이미징 수용체 흡수 신속한 측정하는데 사용될 수있다세포질을 통해 전환은 정의 구획을 분자합니다. 이 수용체 작용제 또는 길항제, 및 억제제의 적용 돌연변이로 인한 차이를 측정하는 단계를 설정한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 논문에 제시된 연구 작업은 캐서린 샌드버그에 부여 R01 HL121456-01A1에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 미국의 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 P30-CA051008에 의해 자금 지원 조지 타운 대학 의료 센터에서 현미경 및 이미지 공유 자원 (MISR)에 라이카 SP8 AOBS의 가용성에 의해 추가로 지원되었다. 우리는 기꺼이 라이카 SP8 영상 피터 존슨 안내, 칼 자이스 현미경 LLC의 알마 아놀드가 제공하는 영상 지원과 조지 타운 대학의 토마스 Coate, 생물학과의 실험실에서 자이스 혈구 LSM880의 사용을 인정합니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
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