Optimalisert Analyse av<em> I Vivo</em> og<em> In Vitro</em> Leversteatose
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
Fedme er et voksende helseproblem i utviklede og utviklingsland. Det har blitt rapportert å være en av de andre sykdomstilstander ofte forbundet med alkoholisk fettleversykdom (NAFLD), med en utbredelse som varierer mellom 30 og 100 prosent i NAFLD pasienter 1. På grunn av den sterke korrelasjonen mellom fettlever og fedme, blir diett-induserte overvektige (DIO) musemodeller mye brukt til å studere de komplekse molekylære mekanismene forbundet med utvikling av NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Leversteatose er den tidligste fasen av NAFLD, og det kan utvikle seg til alkoholisk steatohepatitis (NASH), skrumplever, og til slutt, leverkreft 7. Derfor det overordnede målet med denne metoden er å generere dyre- og cellemodeller av lever steatotic forhold og foOvide detaljerte protokoller for effektiv og nøyaktig lipid måling. Disse modellene og målinger er også nyttige for undersøkelse av andre metabolske lidelser, så som insulinresistens og type 2 diabetes.
Som fedme er kjent for å være en av de viktigste risikofaktorer for NAFLD, en høy-fett, er høy sukrose diett (HFHS) som imiterer vestlig stil fettrik diett brukes til å indusere fedme hos mus. Deretter kan graden av leversteatose vurderes ved hjelp av ulike metoder. Først, kroppsvekt og kroppssammensetning analyse med kjernemagnetisk resonans (NMR) viser lipidakkumulering under mating tid. Den fettmasse og mager masse kan kvantifiseres i en ikke-invasiv og real-time måte.
I tillegg er magnetisk resonansavbildning (MRI) som brukes for å vise både hel-legeme og leveren fordelingen av fett. Den gråtoner signal av MRI-analysen kan bli omdannet til en leselig pseudo-fargebilde, og intensiteten avgråtoner og farge er hemi-kvantifiserbare. Denne teknologien gir unike fordeler for måling av lipidakkumulering i levende dyr. For det andre, histologisk analyse av leveren er den mest brukte metode for å bestemme hepatisk steatose. Hematoxylin og eosin (H & E) farging gir histologiske informasjon, som hepatocytt morfologi og makrofag infiltrering, mens Oil Red O farging viser størrelsen og plasseringen av lipid-dråper i hepatocytter. For det tredje, lipidinnholdet analyse ved anvendelse av kloroform / metanol ekstraksjon er en nøyaktig og kvantitativ måling av leverlipider. Totalt triglyserid og kolesterolnivåer kan måles med biokjemiske metoder. Viktigere, kan også brukes til lipid ekstraksjon analyse og Oil Red O farging i genetisk manipulert eller farmasøytisk behandlede hepatocytter.
Fordelen med den foreliggende fremgangsmåte er utnyttelsen av flere optimaliserte fremgangsmåter for å generere hepatiske steatotic modellerog til omfattende karakterisere fenotyper både in vivo og in vitro. De DIO musemodeller kan rekapitulere de patologi og metabolske fenotyper av menneskelig fatty leversykdom. Andre metabolske parametere hos mennesker kan replikeres i denne modellen også 8. Genereringen av den steatotic hepatocytter modell som reaksjon på høy glukose pluss insulin er effektiv, nyttig og overvinner begrensningen av kostbart og tidkrevende arbeid mus. Samlet utgjør disse metodene er tilstrekkelig og viktig for studier av lever lipid dysfunksjon og insulinresistens under nærings overbelastning.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD er en serie av progressiv leversykdommer som er forbundet med metabolsk syndrom, fedme, insulinresistens eller type 2-diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2) 11. Kjennetegnet av NAFLD er steatose, akkumulering av lipid i hepatocytter. Her er et spekter av metoder presenteres for å karakterisere fenotyper og parametere for leversteatose bruker DIO mus og muse primære hepatocytter. Denne fremgangsmåten kan være nyttig for å belyse de molekylære mekanismer for NAFLD og andre relater…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
