Geoptimaliseerd Analyse van<em> In Vivo</em> en<em> In Vitro</em> Leversteatose
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
Obesitas is een groeiende gezondheidsprobleem in ontwikkelde landen en ontwikkelingslanden. Vermeld is een van de bestaande afwijkingen vaak geassocieerd met niet-alcoholische steatohepatitis (NAFLD), met een prevalentie variërend tussen 30 en 100 procent in NAFLD patiënten 1. Door de sterke correlatie tussen leververvetting en obesitas, zijn dieet-geïnduceerde zwaarlijvige (DIO) muismodellen wijd gebruikt om de complexe moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 bestuderen. Hepatische steatosis het beginstadium van NAFLD, en kan ontwikkelen tot non-alcoholische steatohepatitis (NASH), cirrose, en uiteindelijk, leverkanker 7. Daarom is de algemene doelstelling van deze methode is om dierlijke en mobiele modellen van de lever steatotic voorwaarden te genereren en provide gedetailleerde protocollen voor het efficiënt en nauwkeurig lipide-meting. Deze modellen en afmetingen zijn ook bruikbaar voor het onderzoeken van andere metabole aandoeningen zoals insulineresistentie en type 2 diabetes.
Obesitas is geïdentificeerd als een van de belangrijkste risicofactoren voor NAFLD, een hoog-vet, hoog is sucrose-dieet (HFHS) de westerse stijl vetrijk dieet imiteert gebruikt om overgewicht bij de muis. Vervolgens kan de mate van leversteatose beoordeeld worden met verschillende methoden. Ten eerste, het lichaamsgewicht en lichaamssamenstelling analyse met kernspinresonantie (NMR) tonen de lipide-accumulatie tijdens voedertijd. Het vet en vetvrije massa kan worden gekwantificeerd in een niet-invasieve en real-time manier.
Bovendien is magnetische resonantie beeldvorming (MRI) gebruikt om zowel het gehele lichaam en de lever verdeling van vet vertonen. De grijstinten signaal van de MRI-analyse kan worden omgezet een afbeelding leesbaar pseudo-kleur in, en de intensiteit van dede grijstinten en kleur is hemi-kwantificeerbare. Deze technologie biedt unieke voordelen voor het meten van de accumulatie van lipiden in levende dieren. Ten tweede, histologische analyse van de lever is de meest gebruikte methode om hepatische steatose bepalen. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring geeft histologische, zoals hepatocyt morfologie en infiltratie van macrofagen, terwijl Oil Red O kleuring De maat en de positie van de vetdruppels in hepatocyten. Ten derde, het lipidegehalte analyse met chloroform / methanol extractie is een nauwkeurige en kwantitatieve meting van hepatische lipiden. Total triglyceride en cholesterol niveaus kunnen gemeten worden met biochemische methoden. Belangrijker vetextractie analyse en Oil Red O kleuring kan ook gebruikt worden in genetisch gemanipuleerde of farmaceutisch behandelde hepatocyten.
Het voordeel van de onderhavige werkwijze is het gebruik van meerdere geoptimaliseerd benaderingen hepatische steatotic modellen genererenen volledig karakteriseren fenotypes zowel in vivo als in vitro. De DIO muismodellen kan recapituleren de pathologie en metabole fenotypen van humane leververvetting. Andere metabole parameters bij mensen kunnen worden gerepliceerd in dit model ook 8. Het genereren van de steatotic hepatocyte model vanwege de hoge glucose plus insuline, nuttig en overwint de beperkingen van kostbare en tijdrovende muiswerk. Tezamen zijn deze werkwijzen voldoende en essentieel voor de studie van hepatische dysfunctie lipide en insulineresistentie bij nutriënt overbelasting.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD is een reeks van progressieve leverziekten die is geassocieerd met het metabool syndroom, obesitas, insulineresistentie en type 2 diabetes mellitus (T2DM) 11. Het kenmerk van NAFLD is steatosis, de accumulatie van lipiden in hepatocyten. Hier wordt een scala aan werkwijzen voorgesteld aan de fenotypes en parameters van leversteatose gebruik DIO muizen en primaire hepatocyten karakteriseren. Deze procedure kan nuttig zijn om de moleculaire mechanismen van NAFLD en andere verwante metabolisch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
