の最適化分析<em>インビボ</em>と<em>インビトロ</em>脂肪肝
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
肥満は、先進国と途上国で急成長している健康問題です。 NAFLD患者1で30と100パーセントの間の範囲の有病率で、頻繁に非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）に関連付けられた共存条件の一つであることが報告されています。脂肪肝と肥満との間の強い相関関係を、食餌誘発性肥満（DIO）マウスモデルが広くNAFLD 2、3、4、5、6の開発に関連した複雑な分子機構を研究するために使用されます。肝臓脂肪症は、NAFLDの最も初期の段階であり、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）、肝硬変、そして最終的に、肝臓癌7に進行することができます。したがって、この方法の全体的な目標は、肝脂肪変性条件の動物および細胞モデルを生成し、PRします効率的で正確な脂質測定のための詳細なプロトコルをovide。これらのモデルと測定値はまた、インスリン抵抗性および2型糖尿病のような他の代謝性疾患の研究に有用です。
肥満は、NAFLDのための主要な危険因子の一つであると同定されているように、洋風高脂肪食を模高脂肪、高スクロース食（HFHS）は、マウスにおいて肥満を誘導するために使用されます。その後、肝臓脂肪症の程度は、異なる方法を用いて評価することができます。まず、核磁気共鳴（NMR）を用いて、体重及び体組成の分析は、時間の供給中の脂質の蓄積を示します。脂肪量および除脂肪体重は、非侵襲性リアルタイム方法で定量することができます。
また、磁気共鳴イメージング（MRI）は、全身および脂肪の肝臓分布の両方を示すために使用されます。 MRI分析の階調信号が読みやすい擬似カラー画像に変換し、強度のできますグレースケールや色は半定量化可能です。この技術は、生きた動物における脂質蓄積を測定するためのユニークな利点を提供します。第二に、肝臓の組織学的分析は、肝臓脂肪症を決定するための最も一般的に使用される方法です。オイルレッドO染色は、肝細胞における脂肪滴のサイズと位置を示している、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、このような肝細胞形態学およびマクロファージ浸潤として、組織学的情報を提供します。第三に、クロロホルム/メタノール抽出を使用して、脂質含有量の分析は、肝臓脂質の正確かつ定量的な測定値です。総トリグリセリドおよびコレステロールレベルは、生化学的方法を用いて測定することができます。重要なのは、脂質抽出分析及びオイルレッドO染色はまた、遺伝子操作または薬学的に処理された肝細胞で使用することができます。
本発明の方法の利点は、肝臓の脂肪変性のモデルを生成するために、複数の最適化されたアプローチのその使用でありますそして総合インビボおよびインビトロの両方の表現型を特徴付けます。 DIOマウスモデルは、ヒトの脂肪肝疾患の病理学および代謝表現型を再現することができます。ヒトにおける他の代謝パラメータは、ウェル8のように、このモデルで複製することができます。高グルコース+インスリンに応答して脂肪変性肝細胞モデルの生成は、効率的で便利であり、費用と時間のかかるマウスの仕事の限界を克服します。まとめると、これらの方法は、栄養過負荷時の肝脂質障害およびインスリン抵抗性の研究のための十分かつ不可欠です。
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLDは、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン耐性、または2型糖尿病（T2DM）11に関連付けられている進行性肝疾患のシリーズです。 NAFLDの顕著な特徴は、脂肪症、肝細胞における脂質の蓄積です。ここでは、方法のスペクトル表現型およびDIOマウスおよびマウス初代肝細胞を用いて、肝臓脂肪症のパラメータを特徴付けるために提示されています。この手順は、NAF…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
