Оптимизированный анализ<em> В Vivo</em> и<em> In Vitro</em> Стеатоз печени
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
Ожирение является растущей проблемой здравоохранения в развитых и развивающихся странах. Было сообщено, что одним из условий сосуществующих часто связанных с неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), с преобладанием в диапазоне от 30 до 100 процентов в НАЖБП больных 1. Из – за сильной корреляции между жирной печени и ожирением, диеты , вызванной ожирением (DIO) мышиные модели широко используются для изучения сложных молекулярных механизмов , связанных с развитием НАЖБП 2, 3, 4, 5, 6. Стеатоз печени является самой ранней стадии НАЖБП, и он может прогрессировать до неалкогольного стеатогепатита (NASH), цирроз печени, и в конечном счете, рак печени 7. Таким образом, общая цель этого метода заключается в создании модели на животных и клеточных печеночных steatotic условий и ргOvide подробные протоколы для эффективного и точного измерения липидов. Эти модели и измерения также полезны при исследовании других метаболических расстройств, таких как резистентность к инсулину и диабета 2 типа.
Как ожирение определяется одним из ключевых факторов риска НАЖБП, с высоким содержанием жиров, высоким сахарозу диета (HFHS), имитирующее в западном стиле с высоким содержанием жиров используется, чтобы вызвать ожирение у мышей. Впоследствии, степень стеатоза печени может быть оценено с использованием различных методов. Во-первых, масса тела и анализ состава тела с ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) показывают, накопление липидов во время кормления. Жировой массы и мышечной массы может быть определена количественно в неинвазивной и в режиме реального времени способом.
Кроме того, магнитно-резонансная томография (МРТ) используется, чтобы показать, как всего тела и распределение жира в печени. Полутоновой сигнал анализа МРТ может быть преобразован в читаемом псевдо-цветного изображения, и интенсивностьшкала серого и цвет Hemi-количественному определению. Эта технология обеспечивает уникальные преимущества для измерения накопления липидов в организме живых животных. Во-вторых, гистологический анализ печени является наиболее часто используемым методом определения стеатоза печени. Гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивание дает гистологическое информацию, такую как гепатоцитов морфологии и инфильтрацию макрофагов, в то время как окрашивание масляным красным O показывает размер и положение липидных капель в гепатоцитах. В-третьих, анализ содержание липидов с использованием экстракции хлороформ / метанол, является точным и количественное измерение печеночных липидов. Общие уровни триглицеридов и холестерина может быть измерена с биохимическими методами. Важно отметить, что липидный анализ экстракции и окрашивание масляным красным O также могут быть использованы в генетически трансформировано таким образом, или их фармацевтически лечение гепатоцитов.
Преимуществом данного способа является его использование нескольких оптимизированных подходов для создания печеночные моделей steatoticи всесторонне характеризуют фенотипов как в естественных условиях и в пробирке. Модели DIO мыши могут резюмировать патологии и метаболические фенотипы человека жировой болезни печени. Другие метаболические параметры у человека могут быть воспроизведены в этой модели и в 8. Поколение steatotic гепатоцитов модели в ответ на высокий уровень глюкозы плюс инсулина является эффективным, полезным и преодолевает ограничение дорогостоящим и трудоемким работы мыши. Взятые вместе, эти методы являются достаточными и необходимыми для изучения печеночной дисфункции липидов и резистентности к инсулину во время питательного перегрузкой.
Protocol
Representative Results
Discussion
НЖБП представляет собой ряд прогрессирующих заболеваний печени , что связано с метаболическим синдромом, ожирение, резистентность к инсулину или сахарным диабетом 2 типа (СД2) 11. Отличительной чертой НАЖБП является стеатоз, накопление липидов в гепатоцитах. Здесь спектр ме…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
