Análisis optimizada de<em> En Vivo</em> y<em> In Vitro</em> La esteatosis hepática
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
La obesidad es un problema de salud creciente en los países desarrollados y en desarrollo. Se ha informado de que una de las condiciones coexistentes frecuentemente asociados con la enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), con una prevalencia que oscila entre 30 y 100 por ciento en pacientes con NAFLD 1. Debido a la fuerte correlación entre el hígado graso y la obesidad, obesidad (DIO) modelos de ratón inducidos por la dieta son ampliamente utilizados para estudiar los mecanismos moleculares complejos asociados con el desarrollo de hígado graso no alcohólico 2, 3, 4, 5, 6. La esteatosis hepática es la etapa más temprana de hígado graso no alcohólico, y puede progresar a la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis, y en última instancia, el cáncer de hígado 7. Por lo tanto, el objetivo general de este método es generar modelos animales y celulares de las condiciones esteatósicos hepáticas y para prOvide protocolos detallados para un análisis de lípidos eficiente y precisa. Estos modelos y las mediciones son también útiles para la investigación de otros trastornos metabólicos, tales como resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2.
Como se identifica que la obesidad es uno de los factores de riesgo de hígado graso no alcohólico, un alto contenido de grasa, dieta alta en sacarosa (HFHS) que imita la dieta alta en grasas de tipo occidental se utiliza para inducir la obesidad en ratones. Posteriormente, el grado de esteatosis hepática puede ser evaluada utilizando diferentes métodos. En primer lugar, el peso corporal y el análisis de la composición corporal con la resonancia magnética nuclear (RMN) muestran la acumulación de lípidos durante la hora de comer. La masa grasa y masa magra se pueden cuantificar de una manera no invasiva y en tiempo real.
Además, la resonancia magnética (MRI) se utiliza para mostrar tanto la de todo el cuerpo y la distribución de hígado de grasa. La señal de escala de grises del análisis de MRI se puede convertir una imagen de color pseudo-legible en, y la intensidad dela escala de grises y el color es hemi-cuantificable. Esta tecnología proporciona ventajas únicas para la medición de la acumulación de lípidos en animales vivos. En segundo lugar, el análisis histológico del hígado es el método más comúnmente utilizado para determinar la esteatosis hepática. Hematoxilina y eosina (H & E) tinción histológica proporciona información, tales como la morfología de los hepatocitos y la infiltración de macrófagos, mientras que Oil Red O tinción muestra el tamaño y la posición de las gotas de lípidos en los hepatocitos. En tercer lugar, el análisis del contenido de lípidos mediante la extracción de cloroformo / metanol es una medida precisa y cuantitativa de los lípidos hepáticos. Los niveles totales de colesterol y triglicéridos se pueden medir con métodos bioquímicos. Es importante destacar que, el análisis de extracción de lípidos y Oil Red O tinción también se pueden utilizar en los hepatocitos tratados farmacéuticamente manipulado genéticamente o.
La ventaja del presente método es su utilización de múltiples enfoques optimizados para generar modelos esteatósicos hepáticasy caracterizar exhaustivamente los fenotipos tanto in vivo como in vitro. Los modelos de ratones DIO pueden recapitular la patología y metabólicas fenotipos de la enfermedad de hígado graso humano. Otros parámetros metabólicos en humanos pueden ser replicados en este modelo, así 8. La generación del modelo de hepatocitos grasos sometidos en respuesta a los altos de glucosa e insulina es eficiente, útil y supera la limitación del trabajo costoso y lento ratón. Tomados en conjunto, estos métodos son suficientes y esencial para el estudio de la disfunción hepática de lípidos y resistencia a la insulina durante la sobrecarga de nutrientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hígado graso no alcohólico es una serie de enfermedades hepáticas progresivas que se asocia con el síndrome metabólico, la obesidad, la resistencia a la insulina, o diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 11. El sello distintivo de hígado graso no alcohólico es la esteatosis, la acumulación de lípidos en los hepatocitos. Aquí, un espectro de métodos se presenta para caracterizar los fenotipos y los parámetros de la esteatosis hepática utilizando ratones DIO y hepatocitos primarios de ratón. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
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