Préparation et caractérisation de nouvelles nanoparticules imitant HDL pour l'encapsulation du facteur de croissance nerveuse
Summary
Une homogénéisation simple a été utilisée pour préparer des nanoparticules novatrices, à forte densité et à la lipoprotéine, à encapsuler le facteur de croissance nerveuse. Les défis, les protocoles détaillés pour la préparation des nanoparticules, la caractérisation in vitro et les études in vivo sont décrits dans cet article.
Abstract
L'objectif de cet article est d'introduire des méthodes de préparation et de caractérisation pour les nanoparticules de réduction des nanoparticules (NP) protégées par les facteurs de croissance nerveuse (NGF), à forte densité et à lipoprotéines (HDL). Les HDL sont des NP endogènes et ont été explorés comme des véhicules pour la délivrance d'agents thérapeutiques. Différentes méthodes ont été développées pour préparer les IPs mimés par HDL. Cependant, ils sont généralement compliqués, longs et difficiles à augmenter industriellement. Dans cette étude, l'homogénéisation en une étape a été utilisée pour mélanger les excipients et former les NP prototypes. Le NGF est une protéine hydrosoluble de 26 kDa. Pour faciliter l'encapsulation du NGF dans l'environnement lipidique des NPs mimant HDL, la protamine USP a été utilisée pour former un complexe de paire d'ions avec du NGF pour neutraliser les charges sur la surface de NGF. Le complexe NGF / protamine a ensuite été introduit dans les NP prototypes. L'apolipoprotéine AI a finalement été enduit à la surface des NP. NGF HDI-imitant NPs a montré des propriétés préférables en termeS de la taille des particules, de la distribution des tailles, de l'efficacité du piégeage, de la libération in vitro , de la bioactivité et de la biodistribution. Grâce à la conception minutieuse et à l'exploration de l'homogénéisation dans les NPs mimantant le HDL, la procédure a été grandement simplifiée et les NP ont été rendues évolutives. De plus, de nombreux défis, tels que la séparation du NGF déchargé des NP, la réalisation d'études fiables de libération in vitro et la mesure de la bioactivité des IP, ont été surmontés.
Introduction
Les macromolécules, telles que les protéines, les peptides et les acides nucléiques, sont devenues des médicaments prometteurs et ont attiré une attention considérable au cours des dernières décennies 1 , 2 . En raison de leur efficacité élevée et de leurs modes d'action spécifiques, ils présentent un excellent potentiel thérapeutique pour les traitements du cancer, des maladies immunitaires, du VIH et des affections apparentées 3 , 4 . Cependant, les propriétés physicochimiques, telles que leur grande taille moléculaire, leur structure tridimensionnelle, leurs charges de surface et leur nature hydrophile, rendent la livraison in vivo de ces macromolécules très difficile. Cela entrave considérablement leur utilisation clinique 4 . Les progrès récents dans les systèmes de délivrance de médicaments, tels que les microparticules, les nanoparticules de polymères (NP), les liposomes et les NP lipidiques, ont surmonté ces défis et amélioré significativement la livraison in vivo de macromolécules. HoCertains inconvénients concernant ces cargaisons d'expédition ont été révélés, y compris une faible capacité de chargement du médicament, une faible efficacité de piégeage, une demi-vie courte, une perte de bioactivité et des effets secondaires indésirables 5 , 6 , 7 , 8 . Les systèmes de transporteurs efficaces restent un domaine d'intérêt de recherche. En outre, le développement de méthodes analytiques pour caractériser les NP NP chargés de médicaments est plus difficile pour les macromolécules que pour les petites molécules.
La lipoprotéine de haute densité (HDL) est un NP naturel composé d'un noyau de lipide qui est recouvert d'apolipoprotéines et d'une monocouche de phospholipides. Le HDL endogène joue un rôle essentiel dans le transport des lipides, des protéines et des acides nucléiques grâce à son interaction avec les récepteurs cibles tels que SR-BI, ABCAI et ABCG1. Il a été exploré comme véhicule pour la livraison de différents agents thérapeutiques 9, 10 , 11 , 12 . Différentes méthodes ont été développées pour préparer les IPs mimés par HDL. La dialyse est une approche populaire. Dans cette méthode, les NP sont formés en hydratant un film lipidique à l'aide d'une solution de cholate de sodium. Le sel est ensuite éliminé par une dialyse de 2 jours avec trois tampons 13 . Les méthodes de sonication fabriquent des NP en faisant soigner un mélange de lipides pendant 60 min sous un état de chauffage; Les NP sont encore purifiés par Chromatographie sur gel 14 . La microfluidique génère des NP via un dispositif microfluidique, qui mélange les solutions de phospholipides et d'apolipoprotéine AI (Apo AI) en créant des micro-parrains dans un schéma de focalisation 15 . De toute évidence, ces méthodes peuvent prendre beaucoup de temps, difficiles et difficiles à augmenter industriellement.
Dans cet article, nous présentons la préparation et la caractérisation de nouvelles NPs mimantant HDL pour le nerfEncapsulation du facteur de croissance (NGF). Le NGF est un homodimère de polypeptide lié au disulfure contenant deux monomères polypeptidiques de 13,6 kDa. Une nouvelle procédure pour préparer les NP par homogénéisation, suivie de l'encapsulation du NGF dans les NP, a été développée. Les NNP de NGF ont été caractérisées pour la taille des particules, la distribution des tailles, le potentiel zêta et la libération in vitro . Leur bioactivité a été évaluée pour la croissance des neurites dans les cellules PC12. La biodistribution des NP NGF imitant les NP a été comparée à celle du NGF libre après injection intraveineuse chez la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous démontrons une méthode simple pour préparer les NP NP mimantant le HDL pour l'encapsulation de NGF. Divers systèmes de distribution de NP ont été étudiés pour délivrer des protéines. À l'heure actuelle, de nombreuses préparations NP nécessitent une dialyse, des précipitations au solvant et une hydratation du film. Ces processus sont généralement compliqués et difficiles à relever lors de l'extension. Au cours de ce développement de NP, il a été déterminé que les…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH R03 NS087322-01 à Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
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