Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL'yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu
Summary
Basit homojenizasyon, sinir büyüme faktörünü kapsüllemek için yeni, yüksek yoğunluklu, lipoprotein-taklit nanoparçacıklar hazırlamak için kullanıldı. Bu makalede, nanoparçacık hazırlığı, in vitro karakterizasyon ve in vivo çalışmalar için zorluklar, ayrıntılı protokoller anlatılmıştır.
Abstract
Bu makalenin amacı, sinir büyüme faktörü (NGF) yüklü, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) -impek nanopartiküller (NP) için hazırlama ve karakterizasyon yöntemlerini tanıtmaktır. HDL'ler endojen NP'lerdir ve terapötik ajanlar verilmesi için araçlar olarak araştırılmıştır. HDL'yi taklit eden NP'leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, genellikle karmaşıktır, zaman alıcıdır ve endüstriyel ölçeklendirme için zorlanmaktadır. Bu çalışmada, yardımcı maddeleri karıştırmak ve prototip NP'ler oluşturmak için bir adımlı homojenleştirme kullanılmıştır. NGF, 26 kDa'lık suda çözünür bir proteindir. NGF'nin HDL'yi taklit eden NP'lerin lipid ortamına kapsüllenmesini kolaylaştırmak için protamin USP, NGF yüzeyindeki yükleri nötralize etmek için NGF ile bir iyon-çift kompleksi oluşturmak için kullanıldı. Daha sonra NGF / protamin kompleksi, prototip NP'lere sokuldu. Apolipoprotein AI nihayet NP yüzeyinde kaplandı. NGF HDL'yi taklit eden NP'ler terimde tercih edilen özellikleri gösterdiBoyut dağılımı, tuzaklanma verimi, in vitro serbest bırakma, biyo-aktivite ve biyo-dağılım. HDL'yi taklit eden NP'lerde dikkatli bir tasarım ve homojenleştirme araştırması ile prosedürü büyük ölçüde basitleştirildi ve NP'ler ölçeklenebilir hale getirildi. Üstelik boşaltılan NGF'nin NP'lerden ayrılması, güvenilir in vitro salınım çalışmaları yapılması ve NP'lerin biyoaktivitesinin ölçülmesi gibi çeşitli zorluklar aşılmıştır.
Introduction
Proteinler, peptitler ve nükleik asitler gibi makromoleküller umut verici ilaçlar olarak ortaya çıkmakta ve son on yılda 1 , 2 önemli derecede ilgi görmüştür. Yüksek etkililiği ve spesifik hareket modları nedeniyle, kanser, bağışıklık sistemi hastalıkları, HIV ve ilgili koşullar 3 , 4'ün tedavileri için mükemmel tedavi potansiyeline sahiptirler. Bununla birlikte, büyük molekül boyutu, üç boyutlu yapı, yüzey yükleri ve hidrofilik doğa gibi fizyokimyasal özellikler, bu makromoleküllerin in vivo dağıtılmasını zorlaştırmaktadır. Bu onların klinik kullanımını önemli ölçüde engeller 4 . Mikropartiküller, polimer nanopartikülleri (NP), lipozomlar ve lipid NP'leri gibi ilaç dağıtım sistemlerinde son zamanlarda kaydedilen ilerlemeler, bu güçlükleri aştı ve makro moleküllerin in vivo teslimatını önemli ölçüde geliştirdi. HoDüşük ilaç yükleme kapasitesi, düşük tuzaklanma verimi, kısa yarılanma ömrü, biyoaktivite kaybı ve istenmeyen yan etkiler de dahil olmak üzere, bu teslim kargolarıyla ilgili bazı dezavantajlar ortaya çıkmıştır 5 , 6 , 7 , 8 . Etkili taşıyıcı sistemler, araştırma konusu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, uyuşturucu yüklü NP'leri karakterize etmek için analitik yöntemlerin geliştirilmesi makromoleküller için küçük moleküllerden ziyade daha zorlayıcıdır.
Yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), apolipoproteinler ve bir fosfolipid tek tabaka tarafından kaplanan bir lipid çekirdeğinden oluşan doğal bir NP'dir. Endojen HDL, SR-BI, ABCAI ve ABCG1 gibi hedef reseptörlerle etkileşimi yoluyla lipidlerin, proteinlerin ve nükleik asitlerin taşınmasında kritik bir rol oynamaktadır. Farklı terapötik ajanların verilmesi için bir araç olarak araştırılmıştır 9, 10 , 11 , 12 . HDL'yi taklit eden NP'leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Diyaliz, popüler bir yaklaşımdır. Bu yöntemde, NPs, bir lipid filmi sodyum klorür çözeltisi kullanarak hidratlayarak oluşturulur. Tuz 3 saatlik tamponlarla 2 günlük bir diyaliz vasıtasıyla uzaklaştırılır. Sonikasyon yöntemleri, lipid karışımını ısıtma koşullarında 60 dakika sonikleştirerek NP'leri üretir; NP'ler jel kromatografisiyle ( 14) daha da arıtılır. Mikroakışkanlar, odaklanma modelinde mikrovorteks yaratarak fosfolipidleri ve apolipoprotein AI (Apo AI) solüsyonlarını karıştıran bir mikroakışkan cihaz aracılığıyla NP üretir. Açıkçası, bu yöntemler, endüstriyel ölçeklendirme için zaman alıcı, sert ve zor olabilir.
Bu yazıda, sinir için yeni HDL'yi taklit eden NP'lerin hazırlanması ve karakterize edilmesiBüyüme faktörü (NGF) kapsülleme. NGF, iki 13.6-kDa polipeptid monomeri ihtiva eden bir disülfid bağlı polipeptid homodimeridir. NP'leri homojenizasyon ile hazırlamaya yönelik yenilikçi bir prosedür, ardından NP'ler içine NGF'nin kapsüllenmesi geliştirildi. NGF HDL'yi taklit eden NP'ler parçacık boyutu, boyut dağılımı, zeta potansiyeli ve in vitro salım için karakterize edildi. Biyolojik aktiviteleri, PC12 hücrelerinde nörit büyümesi için değerlendirildi. NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin biyolojik dağılımı, farelerde intravenöz enjeksiyondan sonra serbest NGF'nin biyolojik dağılımı ile karşılaştırıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, NGF kapsüllemesi için HDL'yi taklit eden NP'leri hazırlamak için basit bir yöntem gösteriyoruz. Proteinleri vermek için çeşitli NP dağıtım sistemleri incelenmiştir. Günümüzde birçok NP preparatı diyaliz, çözücü çöktürme ve film hidrasyonunu içermektedir. Bu işlemler genellikle karmaşıktır ve büyütme konusunda zorlayıcıdır. Bu NP gelişiminde, lipidlerin konteynırın cam duvarı ile kuvvetli yapışması olduğu ve bunun ince filmin hidratasyonunda ve katkı ma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R03 NS087322-01 tarafından Dong, X'e desteklenmiştir.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. . Medical application of liposomes. , (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature’s multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
