הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה
Summary
Homogenization פשוט שימש להכנת רומן, צפיפות גבוהה, lipoprotein- חיקוי חלקיקים כדי לתמצת את גורם הגדילה העצבים. אתגרים, פרוטוקולים מפורטים להכנת nanoparticle, אפיון במבחנה , וכן ב vivo מחקרים מתוארים במאמר זה.
Abstract
מטרתו של מאמר זה היא להציג שיטות הכנה ואפיון עבור ננו-חלקיקים (NP) של גורם הגדילה העצבי (NGF) – נטען, בצפיפות גבוהה, ליפופרוטאין (HDL). HDLs הם NPs אנדוגני ו כבר נבדקו כמו כלי רכב עבור משלוח של סוכני טיפול. שיטות שונות פותחו כדי להכין HDL מחקה NPs. עם זאת, הם בדרך כלל מסובך, זמן רב, וקשה עבור התעשייה בקנה מידה. במחקר זה, צעד אחד homogenization שימש לערבב את excipients וליצור את NPs אב טיפוס. NGF הוא חלבון מסיס במים של 26 kDa. כדי להקל על אנקפסולציה של NGF לתוך הסביבה שומנים של HDL חיקוי NPs, protamine USP שימש ליצירת מורכבות זוג יון עם NGF לנטרל את החיובים על פני NGF. המתחם NGF / protamine הוכנס אז לתוך NPs אב טיפוס. Apolipoprotein AI היה סוף סוף מצופה על פני השטח של NPs. NGF HDL – חיקוי NPs הראה תכונות מועדפות בטווחS של גודל החלקיקים, הפצה גודל, יעילות מלכודת, שחרור במבחנה , bioactivity, ביודיסטריבוציזציה. עם תכנון זהיר של חקר homogenization ב HDL חיקוי NPs, ההליך היה פשוט מאוד, ואת NPs נעשו מדרגי. יתר על כן, אתגרים שונים, כגון הפרדת NGF פריקה מן NPs, ביצוע מחקרים אמינים במבחנה שחרור, ומדידת הפעילות הביולוגית של NPs, היו להתגבר.
Introduction
מקרומולקולות, כגון חלבונים, פפטידים וחומצות גרעין, החלו להופיע כתרופות מבטיחות וזכו לתשומת לב רבה בעשורים האחרונים 1 , 2 . בשל היעילות הגבוהה שלהם ואת מצבי פעולה ספציפיים, הם מפגינים פוטנציאל טיפולי נהדר לטיפולים של סרטן, מחלות החיסון, HIV, ותנאים קשורים 3 , 4 . עם זאת, תכונות פיזיוכימיות, כגון גודל המולקולרי הגדול שלהם, מבנה תלת מימדי, חיובים משטח, וטבע הידרופילי, להפוך את vivo המסירה של מקרומולקולות אלה מאתגר מאוד. זה פוגע במידה ניכרת בשימוש הקליני שלהם. ההתקדמות האחרונה במערכות מסירת תרופות, כגון מיקרו-חלקיקים, חלקיקים פולימריים (NP), ליפוזומים ושפכי שומנים בדם, התגברה על אתגרים אלו ושיפרה משמעותית את המשלוח ב- vivo של מקרומולקולות. הואנו חושפים כמה חסרונות לגבי המטענים הללו, כולל יכולת טעינה נמוכה של סמים, יעילות מלכודת נמוכה, מחצית חיים קצרה, אובדן ביו-אקטיביות ותופעות לוואי לא רצויות 5 , 6 , 7 , 8 . מערכות הספק אפקטיביות נותרו תחום עניין מחקרי. יתר על כן, הפיתוח של שיטות אנליטיות לאפיין NPs נטען סמים הוא מאתגר יותר עבור מקרומולקולות מאשר מולקולות קטנות.
ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) הוא NP טבעי המורכב מליבת שומנים המצופה על ידי אפוליפופרוטאינים ו monolayer phospholipid. HDD אנדוגני ממלא תפקיד קריטי בהעברת ליפידים, חלבונים וחומצות גרעין באמצעות האינטראקציה עם קולטני היעד, כגון SR-BI, ABCAI ו- ABCG1. הוא נבדק ככלי להעברת סוכני טיפול שונים 9, 10 , 11 , 12 . שיטות שונות פותחו כדי להכין HDL מחקה NPs. דיאליזה היא גישה פופולרית. בשיטה זו, NPs נוצרים על ידי לחות סרט השומנים באמצעות פתרון cholate נתרן. מלח מוסר מכן באמצעות דיאליזה של יומיים עם שלושה מאגרים 13 . שיטות Sonication לפברק NPs ידי sonicating תערובת השומנים עבור 60 דקות תחת תנאי חימום; NPs הם מטוהרים נוספת באמצעות כרומטוגרפיה ג'ל 14 . Microfluidics מייצר NPs באמצעות מכשיר microfluidic, אשר מתערבב phospholipids ו apolipoprotein AI (Apo AI) פתרונות על ידי יצירת microvortices בדפוס מיקוד 15 . ברור, שיטות אלה יכול להיות זמן רב, קשה, וקשה עבור התעשייה בקנה מידה למעלה.
במאמר זה, אנו מציגים את הכנה ואפיון של NPs חדש HDL חיקוי עבור עצבאנקפסולציה של גורם גדילה (NGF). NGF הוא homiodimer polycptide דיסולפיד מקושר המכיל שני מונומרים פוליפפטיד 13.6-kDa. נוהל חדש להכנת NPs על ידי homogenization, ואחריו אנקפסולציה של NGF לתוך NPs, פותחה. NGP HDL – חיקוי NPs אופיינו עבור גודל החלקיקים, התפלגות גודל, פוטנציאל zeta, ו במבחנה לשחרר. ביואקטיביות שלהם הוערך עבור תולדה neurite בתאי PC12. הפצה ביולוגית של NGP-nff HDL מחקה הושווה לזו של NGF חופשי לאחר הזרקה תוך וריידית בעכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מדגימים שיטה פשוטה להכין NPs HDL מחקה עבור אנקפסולציה NGF. מערכות שונות של משלוח NP נחקרו על מנת לספק חלבונים. נכון לעכשיו, ההכנות NP רבים כוללים דיאליזה, משקעים ממס, ואת הסרט הידרציה. תהליכים אלה הם בדרך כלל מסובך ומאתגר בקנה מידה. במהלך פיתוח NP זה, נקבע כי השומנ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R03 NS087322-01 ל- Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. . Medical application of liposomes. , (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature’s multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
