Preparación y caracterización de nuevas nanopartículas que imitan las HDL para la encapsulación del factor de crecimiento nervioso
Summary
Se utilizó una homogeneización simple para preparar nanopartículas nuevas, de alta densidad, que imitan las lipoproteínas para encapsular el factor de crecimiento nervioso. En este artículo se describen los desafíos, los protocolos detallados para la preparación de nanopartículas, la caracterización in vitro y los estudios in vivo .
Abstract
El objetivo de este artículo es introducir métodos de preparación y caracterización de nanopartículas (NPs) de alta densidad, lipoproteína (HDL) cargadas con factor de crecimiento nervioso (NGF). Los HDLs son NPs endógenos y han sido explorados como vehículos para el suministro de agentes terapéuticos. Se han desarrollado varios métodos para preparar NPs que imitan a HDL. Sin embargo, generalmente son complicados, requieren mucho tiempo y son difíciles para la ampliación industrial. En este estudio, se utilizó una homogeneización en un solo paso para mezclar los excipientes y formar el prototipo de NP. El NGF es una proteína soluble en agua de 26 kDa. Para facilitar la encapsulación de NGF en el medio lipídico de NPs que imitan a HDL, se usó protamina USP para formar un complejo de pares de iones con NGF para neutralizar las cargas sobre la superficie de NGF. El complejo NGF / protamina se introdujo entonces en el prototipo de NP. La apolipoproteína AI fue finalmente recubierta sobre la superficie de los NPs. NGF HDL imitación NPs mostraron propiedades preferibles en términosS de tamaño de partícula, distribución de tamaño, eficacia de atrapamiento, liberación in vitro , bioactividad y biodistribución. Con el cuidadoso diseño y exploración de la homogeneización en las NPs que imitan a HDL, el procedimiento se simplificó en gran medida y los NP se hicieron escalables. Además, se superaron varios desafíos, como la separación del NGF sin carga de los NPs, la realización de estudios fiables de liberación in vitro y la medición de la bioactividad de los NPs.
Introduction
Las macromoléculas, como las proteínas, los péptidos y los ácidos nucleicos, han aparecido como medicamentos prometedores y han adquirido considerable atención en las últimas décadas 1 , 2 . Debido a su alta eficacia y los modos de acción específicos, que muestran un gran potencial terapéutico para los tratamientos de cáncer, la enfermedad inmune, el VIH, y las condiciones relacionadas [ 3 , 4] . Sin embargo, las propiedades fisicoquímicas, tales como su gran tamaño molecular, estructura tridimensional, cargas superficiales y naturaleza hidrófila, hacen que la administración in vivo de estas macromoléculas sea muy difícil. Esto dificulta considerablemente su uso clínico 4 . Avances recientes en sistemas de administración de fármacos, tales como micropartículas, nanopartículas de polímero (NPs), liposomas y NPs lipídicos, superaron estos desafíos y mejoraron significativamente la administración in vivo de macromoléculas. HoSe han revelado algunos inconvenientes con respecto a estas cargas de entrega, incluyendo baja capacidad de carga de fármacos, baja eficacia de atrapamiento, vida media corta, pérdida de bioactividad y efectos secundarios indeseables 5 , 6 , 7 , 8 . Los sistemas portadores eficaces siguen siendo un área de interés para la investigación. Además, el desarrollo de métodos analíticos para caracterizar las NPs cargadas de fármacos es más difícil para las macromoléculas que para las moléculas pequeñas.
La lipoproteína de alta densidad (HDL) es un NP natural compuesto de un núcleo lipídico que está recubierto por apolipoproteínas y una monocapa de fosfolípidos. HDL endógena juega un papel crítico en el transporte de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos a través de su interacción con receptores objetivo, como SR-BI, ABCAI y ABCG1. Se ha explorado como vehículo para la administración de diferentes agentes terapéuticos 9, 10 , 11 , 12 . Se han desarrollado varios métodos para preparar NPs que imitan a HDL. La diálisis es un enfoque popular. En este método, los NPs se forman hidratando una película lipídica usando solución de colato sódico. La sal se elimina a través de una diálisis de 2 días con tres tampones 13 . Los métodos de sonicación fabrican NPs sonicando una mezcla de lípidos durante 60 minutos bajo una condición de calentamiento; Los NPs se purifican adicionalmente mediante cromatografía en gel 14 . Microfluídica genera NPs a través de un dispositivo microfluídico, que mezcla fosfolípidos y apolipoproteína AI (Apo AI) soluciones mediante la creación de microvórtices en un patrón de enfoque [ 15] . Evidentemente, estos métodos pueden llevar mucho tiempo, ser ásperos y difíciles para la ampliación industrial.
En este artículo, introducimos la preparación y caracterización de NPs de imitación de HDL nuevos para el nervioEncapsulación del factor de crecimiento (NGF). El NGF es un homodímero de polipéptido unido por disulfuro que contiene dos monómeros de polipéptido de 13,6 kDa. Se desarrolló un nuevo procedimiento para preparar los NPs mediante homogeneización, seguido por la encapsulación de NGF en los NPs. Los NGF HDL imitación NPs se caracterizaron por tamaño de partícula, distribución de tamaño, potencial zeta, y la liberación in vitro . Su bioactividad se evaluó para el crecimiento de neuritas en células PC12. La biodistribución de NGF HDL imitando NPs se comparó con la de NGF libre después de la inyección intravenosa en ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se demuestra un método simple para preparar HDL-imitación NPs para NGF encapsulación. Se han estudiado varios sistemas de liberación de NP para suministrar proteínas. Actualmente, muchas preparaciones NP incluyen diálisis, precipitación con disolventes e hidratación de películas. Estos procesos son generalmente complicados y desafiantes a escala. Durante este desarrollo de NP, se determinó que los lıpidos tenıan fuerte adhesión a la pared de vidrio del recipiente, lo que condujo a las dific…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH R03 NS087322-01 a Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
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