Voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei Factor
Summary
Eenvoudige homogenisatie werd gebruikt om nieuwe, hoge dichtheid, lipoproteïne-nabootsende nanodeeltjes te bereiden om de zenuwgroeifactor te inkapselen. Uitdagingen, gedetailleerde protocollen voor nanodeeltjespreparatie, in vitro karakterisering en in vivo studies worden beschreven in dit artikel.
Abstract
Het doel van dit artikel is de voorbereiding en karakterisering van nervegroeifactoren (NGF) geladen, hoge dichtheid, lipoproteïne (HDL) -mimicerende nanodeeltjes (NP's) te introduceren. HDL's zijn endogene NP's en zijn onderzocht als voertuigen voor de levering van therapeutische middelen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld om HDL-nabootsende NP's te bereiden. Ze zijn echter over het algemeen gecompliceerd, tijdrovend en moeilijk voor industriële opschaling. In deze studie werd één stap homogenisatie gebruikt om de hulpstoffen te mengen en de prototype NP's te vormen. NGF is een in water oplosbaar eiwit van 26 kDa. Om de inkapseling van NGF in de lipidomgeving van HDL-nabootsende NP's te vergemakkelijken, werd protamine USP gebruikt om een ionpaarcomplex te vormen met NGF om de ladingen op het NGF-oppervlak te neutraliseren. Het NGF / protamine complex werd vervolgens ingevoerd in het prototype NPs. Apolipoproteïne Al werd uiteindelijk op het oppervlak van de NP's gecoat. NGF HDL-nabootsende NP's vertoonden de voorkeurse eigenschappen in termenS met deeltjesgrootte, grootteverdeling, entrapmentefficiëntie, in vitro release, bioactiviteit en biodistributie. Met het zorgvuldige ontwerp en verkenning van homogenisatie in HDL-nabootsende NP's, werd de procedure sterk vereenvoudigd en werden de NP's schaalbaar gemaakt. Bovendien werden verschillende uitdagingen, zoals het scheiden van gelost NGF uit de NP's, het uitvoeren van betrouwbare in vitro vrijlatingstudies en het meten van de bioactiviteit van de NP's overwonnen.
Introduction
Macromoleculen, zoals eiwitten, peptiden en nucleïnezuren, zijn ontstaan als veelbelovende medicijnen en hebben in de afgelopen decennia 1 , 2 veel aandacht gekregen . Door hun hoge werkzaamheids- en specifieke actiemodi hebben ze een groot therapeutisch potentieel voor de behandelingen van kanker, immuunziekte, HIV en aanverwante aandoeningen 3 , 4 . Echter, fysiochemische eigenschappen, zoals hun grote moleculaire grootte, driedimensionale structuur, oppervlakkosten en hydrofiele natuur maken de in vivo afgifte van deze macromoleculen zeer uitdagend. Dit belemmert hun klinische gebruik 4 aanzienlijk. Recente ontwikkelingen in drug delivery systemen, zoals microdeeltjes, polymeer nanodeeltjes (NP's), liposomen en lipide NP's, overwinnen deze uitdagingen en verbeterde de in vivo levering van macromoleculen aanzienlijk. HoWever, sommige nadeel ten aanzien van deze leveringslading is aangetoond, met inbegrip van lage laadcapaciteit, lage opname efficiëntie, korte halveringstijd, verlies van bioactiviteit en ongewenste bijwerkingen 5 , 6 , 7 , 8 . Effectieve draagstersystemen blijven een gebied van onderzoeksbelang. Bovendien is de ontwikkeling van analytische methoden om medicijnbelaste NP's te karakteriseren, meer uitdagend voor macromoleculen dan voor kleine moleculen.
High-density lipoprotein (HDL) is een natuurlijke NP samengesteld uit een lipidekern die wordt bekleed door apolipoproteïnen en een fosfolipide monolaag. Endogene HDL speelt een kritische rol in het transport van lipiden, eiwitten en nucleïnezuren door de interactie met doelreceptoren, zoals SR-BI, ABCAI en ABCG1. Het is onderzocht als een middel voor de levering van verschillende therapeutische middelen 9, 10 , 11 , 12 . Verschillende methoden zijn ontwikkeld om HDL-nabootsende NP's te bereiden. Dialyse is een populaire aanpak. Bij deze werkwijze worden NP's gevormd door hydrateren van een lipidfilm onder toepassing van natriumcholaatoplossing. Het zout wordt vervolgens verwijderd door middel van een tweedaagse dialyse met drie buffers 13 . Sonicatiemethoden vervaardigen NP's door een lipidmengsel gedurende 60 minuten te soniciseren onder een verwarmingsconditie; De NP's worden verder gezuiverd door gelchromatografie 14 . Microfluidica genereert NP's via een microfluïdisch apparaat, dat fosfolipiden en apolipoproteïne AI (Apo AI) oplossingen mengt door microvortices in een focuspatroon 15 te maken . Het is duidelijk dat deze methoden tijdrovend, hard en moeilijk zijn voor industriële opschaling.
In dit artikel introduceren we de voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende NP's voor zenuwenGroei factor (NGF) inkapseling. NGF is een disulfide-gekoppelde polypeptide homodimeer die twee 13,6-kDa polypeptide monomeren bevat. Een nieuwe procedure voor het bereiden van de NP's door homogenisatie, gevolgd door de inkapseling van NGF in de NP's, werd ontwikkeld. De NGF HDL-nabootsende NP's werden gekenmerkt voor deeltjesgrootte, grootteverdeling, zeta-potentieel en in vitro vrijlating. Hun bioactiviteit werd geëvalueerd voor neurietgroei in PC12-cellen. De biodistributie van NGF HDL-nabootsende NP's werd vergeleken met die van vrij NGF na intraveneuze injectie in muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie tonen we een eenvoudige methode om HDL-nabootsende NP's voor NGF-inkapseling te bereiden. Verschillende NP leveringssystemen zijn onderzocht om eiwitten te leveren. Momenteel betrekken veel NP-preparaten dialyse, oplosmiddelafbreking en filmhydratatie. Deze processen zijn over het algemeen gecompliceerd en uitdagend bij opschalen. Tijdens deze NP-ontwikkeling werd vastgesteld dat de lipiden sterke hechting hadden aan de glazen wand van de houder, wat leidde tot de moeilijkheden bij het hydrateren van …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH R03 NS087322-01 naar Dong, X.
Materials
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. . Medical application of liposomes. , (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature’s multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
