באמצעות טכניקה ג'ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה
Summary
טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.
Abstract
פיתוחם של כלים הגנום עריכה לתכנות יש להקל את השימוש של גנטיקה הפוכה כדי להבין את תפקידי רצפים גנומיים ספציפיים לשחק בתפקוד של תאים ואורגניזמים כולו. הגורם הזה כבר סייע מאוד על ידי הקדמה האחרונה של קריספר / מערכת-a Cas9 כלי תכליתי המאפשר לחוקרים כדי לתפעל את הגנום transcriptome כדי, בין שאר, לדפוק, להפיל, או לדפוק בגנים בתוך ממוקד דֶרֶך. לצורך לדפוק גן, קריספר / Cas9 בתיווך הפסקות פעמי גדיל לגייס את מסלול תיקון DNA שאינו הומולוגי שהצטרף-סוף להציג החדרה או מחיקת frameshift-גרימת נוקלאוטידים באתר ההפסקה. עם זאת, RNA מדריך פרט עלול לגרום תופעות מחוץ היעד רצויים, ועל מנת לשלול אלה, שימוש RNAs מדריך המרובה הכרחי. ריבוי זה של מטרות גם אומר הקרנה בנפח גבוה של שיבוטים נדרש, אשר בתורו מעלה את השימוש EFficient טכניקת תפוקה גבוהה כדי גנוטיפ השיבוטים בנוקאאוט. טכניקות גנוטיפ נוכחיות או סובלות מגבלות מובנות או לגרום לעלות גבוהה, ולכן טיווחו אותם מתאימים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, פרט לנו את הפרוטוקול לשימוש פלורסנט PCR, אשר משתמש DNA הגנומי של תא lysate הגולמי כתבנית, ולאחר מכן לפתור את שברי PCR באמצעות ג'ל אלקטרופורזה נימים. טכניקה זו היא מדויקת מספיק כדי לבדל הבדל בסיס-זוג אחד בין שבר ולכן היא מתאימה המעידה על הנוכחות או היעדר frameshift ברצף הקידוד של הגנים הממוקדים. ידיעה מדויקת זה מונע את הצורך ביעילות צעד רצף מאשר ומאפשרת למשתמשים לחסוך זמן ועלויות בתהליך. יתר על כן, טכניקה זו הוכיחה להיות תכליתי genotyping בתאי יונקים שונים של מקורות רקמות שונים הממוקדים ידי RNAs מדריך נגד גנים רבים, כפי שמוצג כאן ובמקומות אחרים.
Introduction
גישות גנטיות הפוכות אפשרו למדענים להבהיר את ההשפעות של שינויים ספציפיים בגנום על התא או אורגניזם שלם. לדוגמא, הביטוי של גן מסוים יכול להיות נחלש ידי גן מציאת 1, 2 (הפחתה חלקית) או נוקאאוט גנטי 3, 4 (אבלציה שלם) כדי לקבוע את ההשפעה שיש לכך על הפונקציה של התא או על התפתחות האורגניזם.
ג'ין ניסויים בנוקאאוט הפכו קלים יותר מאז כניסתה של nucleases לתכנות ספציפי ברצף, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) ו nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs). עם זאת, האפיון היחסי האחרון של התקבץ וביניהם חוזר palindromic קצר בקביעות (קריספר) / מערכת Cas9 עשה את זה קל מאוד עבור כל מעבדה ברחבי העולם לבצע genניסויים בנוקאאוט דואר. בעיקרו של דבר, המערכת קריספר / Cas9 מורכב משני רכיבים-A חיוני RNA מדריך יחיד (sgRNA), אשר מכיר נקשר באמצעות השלמה הבסיס רצף מסוים בגנום, וכן endonuclease שנקרא Cas9. מה שבא אחרי מחייב פעולה מסוימת של מורכבות sgRNA-Cas9 על הדנ"א הגנומי הוא מחשוף פעמיים גדיל של דנ"א. זה, בתורו, מפעיל את מנגנון תגובת ניזק DNA בתא, אשר תוקן לאחר מכן באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) או הומולוגי המסלולים (HR). היות ומנגנון תיקון NHEJ (אבל לא את מנגנון HR) לעתים קרובות תוצאות ההחדרה האקראית או המחיקה של נוקלאוטידים באתר של תיקון, וכתוצאה מכך מוטציות החדרה / מחיקה (indel), הוא עלול לגרום מסגרת הקריאה של אקסון להעביר. מצב זה יכול לגרום נוק אאוט של הגן עקב סיום מוקדם של התרגום וריקבון בתיווך שטויות 5, 6,7.
למרות הנוחות המוענקת על ידי כניסתה של מערכת קריספר / Cas9 ב שחסל גן, גנוטיפ של שיבוטים של תאים ממוקדים נותר צוואר בקבוק, במיוחד תפוקה גבוהה הגדרה 8, 9. טכניקות קיימות או סובלות מגבלות מובנות גדולות או הם יקרים כלכליים. לדוגמה, assay שמאי T7E1, המהווה assay האנזימטית שמזהה חוסר התאמה ב- DNA דופלקסים 10, הוא לא מסוגל להבחין בין שיבוטים wildtype מוטנטים הומוזיגוטים (שיבוטים אשר אללים הם מוטציה זהה), שכן יש שיבוטים אלה אללים זהים ובכך לא מציג חוסר התאמה ב- DNA הרצף שלהם 11. בנוסף, שימוש רצף סנגר, הנחשב את תקן זהב genotyping שיבוטי מוטציה, או בהתקנת תפוקה גבוהה אינו רצוי בשל עלותו הגבוהה. כאן, אנו מציגים Detפרוטוקול שמציק של טכניקת אלקטרופורזה PCR-נימי ג'ל ניאון, אשר יכולה לעקוף את המגבלות של הטכניקות גנוטיפ קיימות האחרות, והוא שימושי במיוחד בביצוע מסך תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. שיטה זו היא טכנית פשוטה לביצוע, חוסך זמן ועלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדפיקות מתוך גן ספציפי בקו תא מודל של בחירה הפכו לשגרת הבהרת התפקיד כי הגן מתנגן כי בהקשר הסלולר בפרט. למעשה, מספר מסכי הגנום זמינים כרגע המשתמשים במערכת קריספר / Cas9 למקד כמעט כל גנים אנושיים הידועים בגנום 14, 15, 16. עם מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לגב 'טאן שי מינימום, הגב' הלן אונג, וד"ר זאו יי שעזר עם ניסויי ג'ל אלקטרופורזה נימים. עבודה זו נתמכה על ידי NMRC / IRG להעניק NMRC / 1314/2011 ו מענק קרן Tier 2 משרד החינוך AcRF MOE2011-T2-1-051.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O’Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
