Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

Summary

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Abstract

De ontwikkeling van programmeerbare genoom-editing tools is het gebruik van reverse genetics om de rol van specifieke genoomsequenties spelen in het functioneren van cellen en hele organismen te begrijpen vergemakkelijkt. Deze oorzaak is enorm geholpen door de recente invoering van de CRISPR / Cas9 systeem een ​​veelzijdige tool waarmee onderzoekers het genoom en transcriptoom manipuleren om, onder andere, knock-out, knock down, of knock in genen in een gerichte manier. Ten behoeve van kloppen van een gen, CRISPR / Cas9 gemedieerde dubbelstrengsbreuken werven de niet-homologe-DNA-end verbinden herstelweg de leesraamverschuivingsinducerende veroorzaken insertie of deletie van nucleotiden te introduceren in de rust plaats. Echter kan een individuele geleider RNA ongewenste off-target veroorzaken, en deze uit te sluiten, het gebruik van meervoudige geleider RNAs nodig. Deze veelheid aan doelen betekent ook dat een hoog volume screening van klonen vereist, wat op zijn beurt roept de toepassing van een efdoende high-throughput techniek om de knock-out klonen genotype. Huidige genotyperingstechnieken ofwel lijden aan inherente beperkingen of maakt hoge kosten, vandaar waardoor ze ongeschikt zijn voor high-throughput doeleinden. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor het gebruik van fluorescente PCR, die genomisch DNA gebruikt uit ruw cellysaat als sjabloon en oplossen van de PCR-fragmenten via capillaire gelelektroforese. Deze techniek is nauwkeurig genoeg om een ​​basenpaar verschil tussen fragmenten differentiëren en derhalve toereikend is dat de aanwezigheid of afwezigheid van een frameshift in de coderende sequentie van het doelgen. Deze nauwkeurige kennis effectief verzet zich tegen de noodzaak van een bevestigende sequencing stap en stelt gebruikers in staat om tijd en kosten te besparen in het proces. Bovendien is deze techniek bewezen veelzijdig genotypering diverse zoogdiercellen uit verschillende weefsels oorsprong doelwit van gids-RNA's tegen talrijke genen, zoals hier en elders getoond.

Introduction

Reverse genetische benaderingen zijn toegestaan ​​wetenschappers om de effecten van specifieke veranderingen ontrafelen in het genoom van de cel of het hele organisme. Bijvoorbeeld kan de expressie van een bepaald gen worden verzwakt door gen knockdown ^{1, 2} (partiële reductie) of gen knockout ^{3, 4} (complete ablatie) om het effect dat dit heeft op de functie van de cel of het bepalen ontwikkeling van het organisme.

Genknockout experimenten gemakkelijker omdat de introductie van sequentiespecifieke programmeerbare nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (talens) worden. Echter, de relatief recente karakterisering van de geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindroom repeat (CRISPR) / Cas9 systeem is het zeer eenvoudig voor elk laboratorium de hele wereld om gen uit te voeren gemaakte knockout experimenten. In wezen is de CRISPR / Cas9 bestaat uit twee essentiële componenten-één hulplijn RNA (sgRNA), die herkent en bindt via basis complementariteit met een specifieke sequentie in het genoom, en een endonuclease genoemd Cas9. Na de specifieke binding en werking van het sgRNA-Cas9 complex op genomisch DNA is dubbelstrengs splitsing van DNA. Dit op zijn beurt activeert de DNA-schade reactiemechanisme in de cel, die vervolgens via de niet-homologe-end-joining (NHEJ) of homologe recombinatie (HR) banen wordt hersteld. Aangezien de NHEJ herstelmechanisme (maar niet de HR mechanisme) resulteert vaak in de willekeurige insertie of deletie van nucleotiden op de plaats van reparatie, waardoor insertie / deletie (indel) mutaties, kan dit leiden tot het leesraam van een exon te verschuiven. Dit kan vervolgens leiden tot de knock-out van het gen door vroegtijdige terminatie van translatie en-nonsense gemedieerde verval ^{5, 6,7.}

Ondanks het gemak verschaft door de invoering van de CRISPR / Cas9 systeem kloppen van een gen, genotypering klonen van doelcellen loopt stuk, vooral in een high-throughput instelling ^{8, 9.} Bestaande technieken ofwel enige hinder inherente beperkingen of financieel kostbaar. Bijvoorbeeld, de inspecteur of T7E1 assay, welke een enzymatische test die mismatches detecteert DNA duplexen ^10, niet in staat onderscheid te maken tussen wildtype klonen en homozygote mutanten (klonen waarvan de allelen identiek gemuteerd) aangezien deze klonen identieke allelen en derhalve geen mismatches aanwezig in de DNA-sequentie ^11. Bovendien, het gebruik van Sanger sequentiebepaling, die wordt beschouwd als de gouden standaard voor het genotyperen van mutante klonen, in een hoge-doorvoer opstelling is ongewenst vanwege de hoge kosten. Hier presenteren we een detailed protocol van de fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek, die de beperkingen van de andere bestaande genotyperingstechnieken kan omzeilen en is vooral nuttig bij het uitvoeren van een high-throughput screen van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Deze methode is technisch eenvoudig uit te voeren en bespaart tijd en kosten.

Protocol

1. Het verkrijgen van CRISPR / Cas9-gerichte Single-cell Clones Zaad HepG2-cellen op een plaat met 6 putjes bij 500.000 cellen per putje in 2 ml antibiotica-vrij Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Transfecteren cellen met plasmide co-expressie Cas9 en specifieke sgRNA tegen het gen van belang onder toepassing van een geschikt transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. <b…

Representative Results

De fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek beschreven wordt verwacht toepasbaar op elk getarget gebied in het genoom worden in vrijwel elke cellijn die vatbaar is voor vreemd DNA afgifte. We hebben eerder de toepassing ervan aangetoond door zich te richten drie genen in een colorectale kanker cellijn 12. Hier tonen we de werkzaamheid in genotypering van een hepatocellulair carcinoom cellijn, HEPG2, gericht, met een CRISPR / Cas9 te bouwen tegen de Pr…

Discussion

Het uitspelen van een specifiek gen in een model cellijn keuze heeft routine voor het ophelderen van de rol die het gen speelt in die specifieke cellulaire context te worden. In feite, verschillende genoom-brede schermen zijn beschikbaar die de CRISPR / Cas9 systeem vrijwel alle bekende menselijke genen gericht in het genoom ^{14, 15, 16.} Met deze grote schermen (of zelfs kleine targeting van individuele genen van belang), is het…

Materials

HEPG2 cells	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade	GE Healthcare	SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)	AITbiotech	None	Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer	AITbiotech	None	Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit	QIAGEN	201223
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic Analyzer	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 Antibody (N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003