باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية
Summary
تقنية التنميط الجيني هو موضح هنا، والتي الأزواج الفلورسنت تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لالشعرية الكهربائي للهلام، ويسمح لالتنميط الجيني الإنتاجية العالية من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب بوساطة نوكلياز. انها تلتف القيود من خلال تقنيات التنميط الجيني أخرى واجهت وهو أكثر فعالية من حيث التكلفة من الطرق التسلسل.
Abstract
وقد سهلت تطوير أدوات الجينوم التحرير للبرمجة باستخدام علم الوراثة العكسية لفهم الأدوار تلعب تسلسل الجينوم محددة في عمل الخلايا والكائنات كلها. تم عرض هذه القضية بمساعدة بجسامة الأخذ في الآونة الأخيرة من كريسبر / نظام واحد Cas9 أداة متعددة الاستعمالات التي تسمح للباحثين لمعالجة الجينوم وTranscriptome على ل، من بين أمور أخرى، ضرب بها، تدق إلى أسفل، أو تدق في الجينات في المستهدفة الطريقة. لغرض ضرب الجينات، كريسبر / Cas9 بوساطة فواصل المزدوج حبلا توظيف غير مثلي، الانضمام نهاية DNA إصلاح مسار لتقديم الإدراج يسبب انزياح الإطار أو الحذف من النيوكليوتيدات في موقع الشوط الاول. ومع ذلك، RNA دليل الفردية قد يسبب آثار غير مرغوب فيها بعيدا عن الهدف، وحكم هذه خارج، واستخدام الرنا دليل متعددة ضروري. هذا التعدد من الأهداف يعني أيضا أن هناك حاجة إلى فحص كبيرة الحجم من الحيوانات المستنسخة، وهذا بدوره يطرح استخدام وسيلة EFficient تقنية عالية الإنتاجية إلى التركيب الوراثي استنساخ خروج المغلوب. تقنيات التنميط الجيني الحالية إما تعاني من القيود المتأصلة أو تكبد تكلفة عالية، وبالتالي جعلها غير صالحة للأغراض الإنتاجية العالية. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لاستخدام الفلورسنت PCR، والذي يستخدم الحمض النووي الجيني من الخلايا المحللة الخام كقالب، ومن ثم حل شظايا PCR عن طريق الكهربائي للهلام الشعرية. هذه التقنية دقيقة بما فيه الكفاية للتمييز فارق واحد قاعدة الزوج بين شظايا وكافية في إشارة إلى وجود أو عدم وجود انزياح الإطار في تسلسل ترميز الجين المستهدف بالتالي. هذه المعرفة الدقيقة يستبعد بالفعل الحاجة إلى خطوة تأكيدية التسلسل ويسمح للمستخدمين لتوفير الوقت والتكلفة في هذه العملية. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت هذه التقنية لتكون مرنة في التنميط الجيني خلايا الثدييات مختلفة من أصول الأنسجة المختلفة التي تستهدفها الرنا دليل ضد العديد من الجينات، كما هو موضح هنا وفي أماكن أخرى.
Introduction
وقد سمحت النهج الوراثية العكسية العلماء لتوضيح آثار التعديلات المحددة في الجينوم على الخلية أو الكائن الحي كله. على سبيل المثال، والتعبير عن جين معين يمكن أن تكون مخففة من الجينات ضربة قاضية 1 و 2 (تخفيض جزئي) أو تعطيل مورثة 3 و 4 (الاجتثاث الكامل) من أجل تحديد تأثير ذلك على وظيفة الخلية أو على تطور الكائن الحي.
أصبحت التجارب الجينات خروج المغلوب من الأسهل منذ بدء nucleases برمجة تسلسل معين، مثل nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs). ومع ذلك، فإن توصيف حديث نسبيا من تجميع تتخللها بانتظام تكرار المتناوب قصيرة (كريسبر) / جعلت نظام Cas9 من السهل للغاية بالنسبة لأي مختبر في جميع أنحاء العالم لأداء جنرالالبريد التجارب خروج المغلوب. في جوهرها، ويتكون النظام / Cas9 كريسبر من عنصرين واحد الأساسية RNA واحد دليل (sgRNA)، الذي يعترف ويربط طريق التكامل قاعدة لتسلسل معين في الجينوم، ونوكلياز داخلية تسمى Cas9. في أعقاب إجراءات محددة ملزمة ومجمع sgRNA-Cas9 على الحمض النووي الجيني هو الانقسام المزدوج حبلا من الحمض النووي. وهذا، بدوره، يؤدي آلية استجابة الحمض النووي من التلف في الخلايا، والتي يتم إصلاح في وقت لاحق عن طريق (HR) مسارات (NHEJ)، الانضمام نهاية أو إعادة التركيب مثلي غير المتجانسة. منذ آلية NHEJ إصلاح (ولكن ليس آلية HR) غالبا ما يؤدي إلى إدخال عشوائي أو الحذف من النيوكليوتيدات في موقع إصلاح، مما أدى إلى إدراج / حذف (INDEL) الطفرات، فإنه قد يتسبب في إطار القراءة من اكسون للتحول. وهذا قد يؤدي ثم في دور الستة عشر من الجينات بسبب الإنهاء المبكر الترجمة وبوساطة هراء تسوس 5، 6،7.
وعلى الرغم من الراحة التي يوفرها تطبيق نظام / Cas9 كريسبر في ضرب الجينات، والتنميط الجيني لاستنساخ الخلايا المستهدفة لا يزال يمثل عنق الزجاجة، وخاصة في تحديد 8 و 9 والإنتاجية العالية. التقنيات الموجودة إما يعانون القيود المتأصلة الكبرى أو هي مكلفة ماليا. على سبيل المثال، مساح أو T7E1 الفحص، وهو فحص الأنزيمية التي يكشف عدم التطابق في DNA دوبلكسات 10، غير قادر على التمييز بين الحيوانات المستنسخة wildtype والمسوخ متماثل (استنساخ الذي الأليلات وتحور مماثل)، لأن هذه الحيوانات المستنسخة لها الأليلات متطابقة وبالتالي لا تقدم عدم التطابق في تسلسل الحمض النووي (11). وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام سانجر تسلسل، والتي تعتبر المعيار الذهبي في التنميط الجيني استنساخ متحولة، في إعداد الإنتاجية العالية غير مرغوب فيه بسبب التكلفة العالية. هنا، نقدم ديتبروتوكول ailed تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت، والتي يمكن الالتفاف على القيود المفروضة على تقنيات التنميط الجيني الأخرى القائمة وغير مفيدة بشكل خاص في أداء شاشة عالية الإنتاجية من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب بوساطة نوكلياز. وهذه طريقة بسيطة من الناحية الفنية لأداء ويوفر الوقت والتكلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبح يطرق من جين معين في خط خلية نموذج الاختيار روتين لتوضيح الدور الذي الجين يلعب في هذا السياق الخلوي معين. في الواقع، العديد من الشاشات على نطاق الجينوم متوفرة حاليا التي تستخدم كريسبر / نظام Cas9 لاستهداف الجينات البشرية تقريبا جميع المعروفة في الجينوم 14</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة تان شي مين، السيدة هيلين اونج، والدكتور زاو يي لمساعدة مع التجارب الشعرية الكهربائي للهلام. وأيد هذا العمل من قبل NMRC / IRG منح NMRC / 1314/2011 وزارة التربية والتعليم AcRF المستوى 2 منحة صندوق MOE2011-T2-1-051.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O’Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
