Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format
Summary
Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.
Abstract
Die Entwicklung von programmierbaren genom Editing-Tool hat die Verwendung von Reverse Genetik erleichtert die Rollen spezifische genomischen Sequenzen spielen in der Funktion von Zellen und ganzen Organismen zu verstehen. Diese Ursache wurde durch die kürzliche Einführung des CRISPR / Cas9 system eines vielseitiges Werkzeug, das Forscher ermöglicht zu manipulieren das Genom und Transkriptom, um unter anderem, knock out, knock down, oder Klopfen in Genen in einem gezielten enorm geholfen Weise. Für die Zwecke der Ausschlagen ein Gens, CRISPR / Cas9 vermittelte Doppelstrangbrüche, die nicht-homologe end-joining DNA-Reparaturwegs rekrutieren, um die Frameshift-verursachende Insertion oder Deletion von Nukleotiden an der Bruchstelle einzuführen. Jedoch kann eine einzelne Führungs RNA unerwünschte Nebeneffekte verursachen, und diese auszuschließen, die Verwendung von mehreren Führungs RNAs notwendig. Diese Vielzahl von Zielen, bedeutet auch, dass ein High-Volume-Screening von Klonen benötigt wird, was wiederum die Verwendung eines ef bittetreichend Hochdurchsatz-Technik, um den Knockout-Klone genotypisieren. Aktuelle Genotypisierung Techniken entweder von inhärenten Einschränkungen leiden oder hohe Kosten entstehen, damit sie nicht geeignet für Hochdurchsatz-Zwecke zu machen. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-PCR, die genomische DNA aus einem rohen Zelllysat als Templat verwendet, und dann die Lösung der PCR-Fragmente über Kapillargelelektrophorese. Diese Technik ist genau genug, um eine Basenpaarunterschied zwischen Fragmenten zu unterscheiden, und somit ist ausreichend, in der Gegenwart oder Abwesenheit einer Rasterverschiebung in der kodierenden Sequenz des Zielgens anzeigt. Diese genaue Kenntnis schließt effektiv die Notwendigkeit für eine bestätigende Sequenzierung Schritt und ermöglicht es Benutzern, Zeit und Kosten in den Prozess zu speichern. Darüber hinaus hat diese Technik in Genotypisierung verschiedene Säugetierzellen verschiedenen Gewebe Ursprünge durch Führungs RNAs gegen zahlreiche Gene gezielt zu vielseitig erwiesen, wie hier und anderswo gezeigt.
Introduction
Reverse genetische Ansätze erlaubt haben Wissenschaftler die Auswirkungen von spezifischen Veränderungen im Genom auf der Zelle oder ganzen Organismus aufzuklären. Zum Beispiel kann die Expression eines bestimmten Gens durch Knock-Down 1, 2 (teilweise Reduktion) oder Gen – Knockout – 3, 4 (vollständige Ablation), um den Effekt zu bestimmen , abgeschwächt wird , dass diese auf der Funktion der Zelle oder auf der Entwicklung des Organismus.
Gen-Knockout-Versuche haben sich einfacher, da die Einführung von sequenzspezifischen programmierbaren Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs) und Transkriptions-Aktivator-like-Effektor Nukleasen (TALENS). die relativ neue Charakterisierung des gruppierte jedoch regelmäßig kurze Palindrom-Wiederholung (CRISPR) / Cas9 System hat es extrem einfach für jedes Labor auf der ganzen Welt durchzuführen gen setztee-Knockout-Experimente. Im Wesentlichen besteht die CRISPR / Cas9 System aus zwei wesentlichen Komponenten eines einzigen Führungs-RNA (sgRNA), die über die Basis Komplementarität zu einer bestimmten Sequenz in dem Genom und binden erkennt, und eine Endonuclease Cas9 genannt. Die Folgen der spezifischen Bindung und Wirkung des sgRNA-Cas9 Komplexes auf genomische DNA ist die Doppelstrang-Spaltung von DNA. Dies wiederum löst den DNA-Schadensantwort-Mechanismus in der Zelle, die anschließend über die nicht-homologen end-joining (NHEJ) oder homologe Rekombination (HR) Wege repariert wird. Da der NHEJ Reparaturmechanismus (aber nicht der HR-Mechanismus) häufig in der zufälligen Insertion oder Deletion von Nukleotiden an der Stelle der Reparatur führt, was zu einer Insertion / Deletion (indel) Mutationen, kann es der Leserahmen eines Exons führen zu verschieben. Dies kann in den Knockout des Gens durch vorzeitige Termination der Translation und Nonsense-vermittelten Zerfalls 5, 6 ergeben sich dann,7.
Trotz der Bequemlichkeit durch die Einführung des CRISPR / Cas9 Systems liefert in Klopfen ein Gens aus der Genotypisierung von Klonen von Zielzellen bleibt ein Engpass, insbesondere in einem Hochdurchsatz – 8 Einstellung 9. Bestehende Techniken entweder leide große inhärente Einschränkungen oder sind finanziell kostspielig. Zum Beispiel kann der Vermesser oder T7E1 Assay, der ein enzymatischer Assay, das Fehlpaarungen in DNA erkennt Duplexen 10 ist nicht in der Lage zwischen Wildtyp- Klone und homozygoten Mutanten (Klone , deren Allele mutiert sind identisch), da diese Klone haben identische Allele und damit zu unterscheiden stellt keine Fehlpaarungen in ihrer DNA – Sequenz 11. Darüber hinaus ist die Verwendung von Sanger-Sequenzierung, die der Goldstandard in der Genotypisierung mutierten Klone betrachtet wird, in einem Hochdurchsatzaufbau ist nicht wünschenswert, aufgrund seiner hohen Kosten. Hier präsentieren wir eine detailed Protokoll der fluoreszierenden PCR-Kapillar-Gelelektrophorese-Technik, die die Grenzen der anderen vorhandenen Genotypisierung Techniken umgehen kann, und ist besonders nützlich, um einen Hochdurchsatz-Bildschirm von Nuklease-vermittelte Knockout-Klone in der Durchführung. Dieses Verfahren ist technisch einfach durchzuführen und spart Zeit und Kosten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ausschlagen eines spezifischen Gens in einem Modell-Zelllinie der Wahl ist zur Routine geworden, die Rolle für die Aufklärung, dass das Gen in diesem bestimmten zellulären Kontext spielt. In der Tat sind einige genomweite Bildschirme zur Zeit zur Verfügung , die die CRISPR / Cas9 System verwenden nahezu alle bekannten menschlichen Genen in das Genom 14 zielen, 15, 16. Mit diesen großflächigen Bildschirmen (oder sogar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich Frau Tan Shi Min, Frau Helen Ong, und Dr. Zhao Yi für die Hilfe bei der Kapillar-Elektrophorese-Experimente danken. Diese Arbeit wurde von NMRC / IRG gewährt NMRC / 1314/2011 und MOE ACRF Tier-2-Fonds Zuschuss MOE2011-T2-1-051 unterstützt.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
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