Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью
Summary
Метод генотипирования, описанный здесь, который соединяет флуоресцентные полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием капиллярного электрофореза гель, позволяет с высокой пропускной способностью генотипирования нуклеазы-опосредованной нокаутом клонов. Он преодолевает ограничения, с которыми сталкиваются другие методы генотипирования и является экономически более эффективным, чем методы секвенирования.
Abstract
Развитие программируемых инструментов генома редактирования способствовало использованию обратной генетики для понимания роли конкретных геномные последовательности играют в функционировании клеток и целых организмов. Эта причина была чрезвычайно способствовали недавнему введению CRISPR / система-а cas9 универсального инструмента, который позволяет исследователям манипулировать геном и транскрипт, с тем чтобы, среди прочего, выбивать, сбить или постучать в генах в целевом манера. С целью выбивания гена, CRISPR / cas9-опосредованный двунитевые разрывы рекрутировать негомологичный концевой соединительную ДНК ремонт пути, чтобы ввести вызывающий сдвиг рамки вставки или удаление нуклеотидов в месте разрыва. Однако, индивидуальный гид РНК может вызвать нежелательные эффекты вне цели, и исключить их из, использование нескольких направляющих РНК необходимо. Эта множественность целей также означает, что в больших объемах скрининг клонов требуется, что в свою очередь напрашивается использование эфficient высокой пропускной метод к генотипу Нокаут клонов. Современные методы генотипирования либо страдают от ограничений, присущих или нести высокую стоимость, следовательно, делает их непригодными для целей с высокой пропускной способностью. Здесь мы подробно протокол для использования флуоресцентного ПЦРА, который использует геномную ДНК из клеточного лизата сыр в качестве матрицы, а затем разрешения фрагментов ПЦРА через капиллярный электрофорез в геле. Этот метод является достаточно точным, чтобы дифференцировать разницу один пар оснований между фрагментами и, следовательно, является адекватным что указывает на наличие или отсутствие в рамки считывания кодирующей последовательности гена-мишени. Это точное знание эффективно устраняет необходимость в подтверждающем этапе секвенирования и позволяет сэкономить время и затраты в процессе. Кроме того, эта методика оказалась универсальными в генотипирования различных клеток млекопитающих различного происхождения ткани целевого направляющего РНК против многочисленных генов, как показано здесь и в других местах.
Introduction
Обратные генетические подходы позволили ученым выяснить влияние специфических изменений в геноме на клетки или всего организма в целом. Например, экспрессия специфического гена может быть ослаблена гена бросовой 1, 2 (частичное восстановление) или гена нокаут 3, 4 (полная абляции) для того , чтобы определить влияние , что это оказывает на функции клетки , или на развитие организма.
Эксперименты нокаута гена стали легче после введения последовательности специфической программируемых нуклеаз, таких как цинк-нуклеазы пальцев (ZFNs) и активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс). Однако сравнительно недавно характеризация кластеризованную регулярно перемежается короткое палиндромное повторение (CRISPR) / система cas9 сделала его очень легко для любой лаборатории по всему миру, чтобы выполнить гене выколотки эксперименты. По существу, система CRISPR / cas9 состоит из двух важных компонентов-одной направляющей РНК (sgRNA), который распознает и связывает через базовую комплементарности к определенной последовательности в геноме, и эндонуклеазы под названием cas9. Последствия специфического связывания и действий комплекса sgRNA-cas9 на геномной ДНК представляет собой двухцепочечное расщепление ДНК. Это, в свою очередь, приводит в действии механизма реагирования повреждения ДНК в клетке, который впоследствии отремонтированная с помощью негомологичного концевого присоединения (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HR) путей. Поскольку механизм NHEJ ремонта (но не механизм HR) часто приводит к случайной вставки или делеции нуклеотидов в месте ремонта, в результате вставки / удаления (INDEL) мутации, это может привести к рамки считывания экзона сдвиг. Затем это может привести к нокаута гена из – за преждевременной терминации трансляции и нонсенс-опосредованного распада 5, 6,7.
Несмотря на удобство , обеспечиваемой введением системы CRISPR / cas9 в выбивания ген, генотипирование клонов клеток – мишеней остается узким местом, особенно в настройке 8, 9 с высокой пропускной способностью . Существующие методы либо страдают основные недостатки, присущие или являются финансово дорогостоящими. Например, СЮРВЕЙЕРСКИЙ или T7E1 анализ, который представляет собой анализ ферментативного , который обнаруживает несоответствия в ДНК дуплексами 10, не способен различать дикий тип клоны и гомозиготными мутант (клоны , у которых аллели мутируют тождественно), так как эти клоны имеют идентичные аллели и , таким образом , не представляют несовпадения в их последовательности ДНК 11. Кроме того, использование Sanger секвенирования, который считается золотым стандартом в генотипирования мутантных клонов, в установке с высокой пропускной способностью нежелательно из-за его высокой стоимости. Здесь мы представляем йеПротокол болело флуоресцентного ПЦР-капиллярного метода гель-электрофореза, который может обойти ограничения других существующих методов генотипирования и является особенно полезным при выполнении экран высокого пропускной способности нуклеазы-опосредованной нокаутом клонов. Этот метод технически прост в исполнении и экономит время и затраты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выбивание определенного гена в модельном клеточной линии выбора стали обычным для выяснения той роли, которую играет ген в этой конкретной сотовой связи. В самом деле, несколько общегеномных экранов в настоящее время доступны , которые используют систему / cas9 CRISPR целевой практически в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Тан Ши Мин, г-жа Хелен Онг, и д-р Чжао Йи за помощь в экспериментах электрофореза капиллярного геля. Эта работа была поддержана NMRC / IRG грант NMRC / 1314/2011 и МОС ACRF Tier 2 гранта Фонда MOE2011-T2-1-051.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O’Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
