Genotypning teknik som beskrivs här, vilken kopplar fluorescerande polymeraskedjereaktion (PCR) för att kapillär gelelektrofores, möjliggör hög genomströmning genotypning av nukleas-medierad knockout kloner. Det kringgår begränsningar av andra genotypning teknik möter och är mer kostnadseffektiv än sekvenseringsmetoder.
Utvecklingen av programmerbara genomet-redigeringsverktyg har underlättat användningen av omvänd genetik för att förstå rollerna specifika genomsekvenser spelar i hur celler och hela organismer. Denna sak har oerhört hjälp av den nyligen införda av CRISPR / Cas9 system ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt för forskare att manipulera genomet och transkriptom för att, bland annat, slå ut, riva eller slå in gener i en riktad sätt. För ändamålet att slå ut en gen, CRISPR / Cas9-förmedlad dubbel-strängbrott rekrytera icke-homolog-ändförening DNA-reparationsvägen för att införa den ramförskjutning som orsakar insättning eller deletion av nukleotider vid brottområdet. Dock kan en enskild styr RNA orsaka oönskade off-target effekter och att utesluta dessa ut, är det nödvändigt att använda flera styr RNA. Denna mångfald av mål innebär också att en hög volym screening av kloner krävs, vilket i sin tur väcker användningen av en efräckligt hög genomströmning teknik för att genotypa knockout kloner. Aktuella genotypning tekniker antingen lider av inneboende begränsningar eller ådra höga kostnader, därmed gör dem olämpliga för hög genomströmning ändamål. Här, vi detalj protokollet för användning av fluorescerande PCR, vilken använder genom-DNA från råa cellysat som en mall, och sedan lösa de PCR-fragmenten via kapillär gelelektrofores. Denna teknik är tillräckligt noggranna för att skilja en baspar skillnad mellan fragment och därmed är tillräcklig i indikerar närvaron eller frånvaron av en läsramsförskjutning i den kodande sekvensen av den målinriktade genen. Denna exakta kunskaper utesluter effektivt behovet av ett bekräftande sekvense steg och tillåter användare att spara tid och kostnader i processen. Dessutom har denna teknik visat sig vara mångsidig i genotypning olika däggdjursceller av olika vävnadsursprung riktade av styr RNA mot ett stort antal gener, såsom visas här och annorstädes.
Omvända genetiska tillvägagångssätt har tillåtit forskare att belysa effekterna av specifika förändringar i genomet på cellen eller hela organismen. Till exempel, kan expressionen av en särskild gen dämpas genom gen knockdown 1, 2 (partiell reduktion) eller gen-knockout 3, 4 (fullständig ablation) för att bestämma den effekt som detta har på funktionen hos cellen eller på den utveckling av organismen.
Gen-knockout experiment har blivit lättare sedan införandet av sekvensspecifika programmerbara nukleaser, såsom zink-finger nukleaser (ZFNs) och transkriptionsaktivaliknande effektorceller nukleaser (Talens). Men den relativt nyligen karakterisering av klustrade regelbundet varvas korta palindrom repeat (CRISPR) / Cas9 systemet har gjort det mycket enkelt för laboratorie runt om i världen för att utföra gene knockoutexperiment. I huvudsak består den CRISPR / Cas9 system av två väsentliga komponenter-en enda styr RNA (sgRNA), som känner igen och binder via bas komplementaritet till en specifik sekvens i genomet, och ett endonukleas som kallas Cas9. Följderna av den specifika bindningen och verkan av sgRNA-Cas9 komplex på genomiskt DNA är den dubbelsträngklyvning av DNA. Detta i sin tur, utlöser DNA-skada svarsmekanism i cellen, som därefter repareras via de icke-homologa end-joining (NHEJ) eller homolog rekombination (HR) vägar. Eftersom reparationsmekanism NHEJ (men inte HR mekanism) resulterar ofta i den slumpmässiga insertion eller deletion av nukleotider vid platsen för reparation, vilket resulterar i insertion / deletion (InDel) mutationer, kan det orsaka läsramen för en exon att skifta. Detta kan då resultera i knockout av genen på grund av för tidig terminering av translation och nonsens-medierad sönderfall 5, 6,7.
Trots bekvämligheten som erbjuds genom införandet av CRISPR / Cas9 systemet i att knacka ut en gen, genotypning av kloner av riktade celler förblir en flaskhals, särskilt i en hög genomströmning inställning 8, 9. Existerande tekniker antingen drabbas stora inneboende begränsningar eller är ekonomiskt kostsamt. Till exempel, är inte i stånd att skilja mellan vildtyp kloner och homozygota mutanter lantmätaren eller T7E1 analys, vilket är en enzymatisk analys som detekterar felparningar i DNA-duplex 10, (kloner vars alleler är muterade identiskt), eftersom dessa kloner har identiska alleler och således inte utgör felparningar i deras DNA-sekvens 11. Dessutom är icke önskvärt att använda Sanger-sekvensering, som anses vara den gyllene standarden i genotypning mutanta kloner, i en hög genomströmning inställning på grund av dess höga kostnad. Här presenterar vi en Detailed protokoll av det fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik, som kan kringgå begränsningarna hos andra befintliga genotypning tekniker och är särskilt användbar vid utförande av en hög genomströmning skärm av nukleas-medierad knockout kloner. Denna metod är tekniskt enkelt att utföra och sparar tid och kostnader.
Den slår ut av en specifik gen i en modell cellinje val har blivit rutin för att belysa den roll som genen spelar i det särskilda cellulära sammanhang. I själva verket flera genomvida skärmar är för närvarande tillgängliga som använder CRISPR / Cas9 system för att rikta praktiskt taget alla kända humana gener i genomet 14, 15, 16. Med dessa stora skärmar (eller till och med småskalig inriktning av enskilda gener …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Ms Tan Shi Min, Ms Helen Ong och Dr. Zhao Yi för att hjälpa med kapillärgelelektrofores experiment. Detta arbete stöddes av NMRC / IRG bevilja NMRC / 1314/2011 och MOE ACRF Tier 2 Fund bidrag MOE2011-T2-1-051.
HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |