Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden.
Abstract
Studien über die Skelettmuskelphysiologie stehen vor der technischen Herausforderung, in geeigneter Weise die Proben Verarbeitungsabschnitte mit deutlich sichtbaren cytoplasmatischen Kompartimenten zu erhalten. Eine weitere Hürde ist die enge Apposition von Muskelfasern zu den umliegenden Geweben. Da der Prozess der Gewebefixierung und Paraffineinbettung der Schrumpfung von Muskelfasern führt, Gefrieren ist ein optimales Mittel zum Härten Muskelgewebe zur Sektionierung. Allerdings ist ein häufig auftretendes Problem, die Bildung von Eiskristallen, tritt während der Herstellung von Gefrierschnitten aufgrund des hohen Wassergehalt des Muskels. Das Protokoll hier vorgestellte erste beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Muskelgewebe richtig Einfrieren, indem sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht wird. Das Problem bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff allein ist, dass es die Bildung einer Stickstoffgasbarriere bewirkt neben das Gewebe, das als Isolator wirkt und hemmt die Kühlung der Gewebe. Um dies zu vermeiden „Dampfdecke“ -Effekt, ein new Kryoröhrchen wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung um die Gewebeoberfläche zu erhöhen. Dies wurde durch Stanzen eines insgesamt 14 Einlassöffnungen in der Wand des Fläschchens erreicht. Nach Blasendynamik, eine höhere Rate des Flüssigkeitsstrom führt zu kleineren Blasen und weniger Chancen eine Gasbarriere zu bilden. Wenn flüssiger Stickstoff die Kryoröhrchen durch die Einlasslöcher strömt, ist die Strömungsgeschwindigkeit um das Gewebe schnell genug, um die Gasbarriere zu beseitigen. Im Vergleich zu dem Verfahren von Muskelgewebe Einfrieren unter Verwendung von vorgekühltes Isopentan, ist dieses Protokoll einfacher und effizienter und kann verwendet werden, Muskel in einem Durchsatz Weise einzufrieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren optimal für Institutionen, die keinen Zugang zu Isopentan haben, die bei Raumtemperatur extrem leicht entflammbar ist.
Introduction
Der Skelettmuskel ist das wertvollste Komponente eines fleischproduzierenden Tieres aus der Ernährungs- und verarbeitungstechnischer Sicht. In der Fleischindustrie gibt es zwei besonders kritische Aspekte: die Effizienz des Muskelwachstums und der Qualität des resultierenden Fleisch. Als Hauptbestandteil des Muskels, sind Muskelfasern zu Wachstum und frische Fleischqualität 1 bei Tieren direkt in Zusammenhang steht. Zum Beispiel ist die Gesamtanzahl von Fasern (TNF) und die Querschnittsfläche der Fasern (CSAF) meist Muskelmasse und Fleischqualität bestimmen; auch, Fasertyp Zusammensetzung (FTC) wirkt sich stark auf frische Fleischqualität 2. Daher ist die Manipulation von Muskelfasereigenschaften bei Tieren eine sehr wirksame Methode 1 den Kern der Rentabilität und die Wettbewerbsfähigkeit der Betriebe zu erhöhen.
Bis heute wurden mehrere intrinsische und extrinsische Faktoren identifiziert worden, Muskelfaser characterist zu manipulierenics 1. Diese Manipulation kann durch die gezielte Auswahl von Tieren mit spezifischen Genen, wie die Myostatin – Gene in cattle 3, das Callipyge Gen in sheep 4 und die RYR1 und IGF2 Gene in pigs 5 erreicht werden. Auch Ernährung Kontrolle und Behandlungen mit spezifischen Hormone spielen eine wichtige Rolle bei der Muskelfasereigenschaften 6. So ein Ansatz, die genetischen und Ernährungsfaktoren kombiniert könnte Muskelfleischanteil und Fleischqualität verbessern kann. Allerdings Studien über Muskelfasern sind in der Fleischindustrie, weil die Aufklärung der Struktur von Muskelfasern begrenzt noch eine Herausforderung.
Muskelfasereigenschaften werden unter Verwendung histochemischer Methoden, wie beispielsweise die Myosin Adenosintriphosphatase (ATPase) -Assay identifiziert. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass die in dünnen (6-8 um) gefroren Abschnitte angeordnet EnzymeMuskelfasern chemisch reagiert mit bestimmten Produkten werden kann. Jedoch ist der Wassergehalt der Muskeln mehr als 75% bei Schweinen, Kaninchen, Mäusen und Menschen, unabhängig von der Position ( das heißt, Rücken, Bauch oder hinteren Gliedmaßen) 7. Solche hohen Feuchtigkeitsgehalt in Muskeln verursacht eine häufig auftretende Problem – Einfrieren Artefakte – bei der Herstellung von Gefrierschnitten, wie zuvor beschrieben , 8, 9. In den meisten Fällen ist es fast unmöglich, in geeigneter Weise zu Muskelgewebe in einem Schlachthof Produktionslinie, nach unserer Erfahrung einzufrieren.
Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt ein einfaches und effizientes Verfahren in unserem Labor verwendete Muskelgewebe einzufrieren für in einer Hochdurchsatz-Art und Weise Kryoschneiden. Der Höhepunkt dieses Verfahrens ist ein neues, die für Flash-Kryoröhrchen Frieren Muskelgewebe in flüssigem Stickstoff ausgelegt ist. Der aktuelle Workflow kann gleichzeitig Gewebe erleichternEinfrieren und die Verarbeitung für einen ausgezeichneten Muskel Kryoschnitt, mit einem deutlich sichtbar cytoplasmatischen Kompartiment und der engen Apposition von Muskelfasern an das umgebenden Gewebe. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf eine breite Palette von Möglichkeiten für Gewebeanalyse angewendet werden, da flüssiger Stickstoff mit Gewebe nicht mischen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein neues, Mehrloch Kryoröhrchen zum Einfrieren und Speicher von Muskelgewebe zu histologischer Beurteilung der Muskelfunktion führen. Der kritische Schritt in diesem modifizierten Protokoll ist, dass die Probe in den Mehrloch-Kryoröhrchen direkt in flüssigem Stickstoff eingetaucht ist. Unser Wissen ist dies die einfachste und rapidest Art und Weise ausgezeichnete gefrorene Proben für Muskel Kryoschneiden unter den bestehenden Gefrierverfahren zu erhalten (siehe die repräsentativen Ergebnisse)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
31301950 und 31671288: Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC) unterstützt.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
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