Una multi-foro esageratamente Elimina gelati Imperfezioni muscoli sono direttamente immerso in azoto liquido
Summary
Questo protocollo descrive una procedura di congelamento tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Questo protocollo evidenzia anche un nuovo esageratamente che può evitare l'effetto "coperta" di gas azoto quando i contatti di azoto liquido la superficie del tessuto di un campione.
Abstract
Studi sulla fisiologia del muscolo scheletrico affrontare la sfida tecnica di trattare opportunamente i campioni per ottenere sezioni con vani citoplasmatici ben visibili. Un altro ostacolo è la stretta apposizione di miofibre ai tessuti circostanti. Poiché il processo di fissaggio di tessuto e in paraffina conduce alla contrazione delle fibre muscolari, congelamento è un mezzo ottimali di indurimento tessuto muscolare per il sezionamento. Tuttavia, un problema di frequente riscontro, la formazione di cristalli di ghiaccio, si verifica durante la preparazione delle sezioni congelate a causa del alto contenuto di acqua del muscolo. Il protocollo presentato qui in primo luogo descrive un metodo semplice ed efficace per il congelamento correttamente tessuti muscolari immergendole in azoto liquido. Il problema con l'utilizzo di azoto liquido da solo è che provoca la formazione di una barriera al gas azoto accanto al tessuto, che funge da isolante e inibisce il raffreddamento dei tessuti. Per evitare questo effetto "coperta di vapore", a neesageratamente w è stato progettato per aumentare la velocità di flusso del liquido intorno alla superficie del tessuto. Questo è stato ottenuto per tranciatura di un totale di 14 fori di ingresso nella parete del flaconcino. Secondo dinamiche bolla, un più alto tasso di risultati di flusso del liquido in bolle più piccole e meno probabilità di formare una barriera al gas. Quando l'azoto liquido fluisce nella esageratamente attraverso i fori di ingresso, la velocità di flusso intorno il tessuto è abbastanza veloce per eliminare la barriera ai gas. Rispetto al metodo di congelamento tessuti muscolari utilizzando isopentano pre-raffreddato, questo protocollo è più semplice e più efficiente e può essere utilizzato per bloccare il muscolo in modo di throughput. Inoltre, questo metodo è ottimale per gli istituti che non hanno accesso a isopentano, che è estremamente infiammabile a temperatura ambiente.
Introduction
Il muscolo scheletrico è la componente più importante di un animale produttrice di carne dal punto nutrizionale e l'elaborazione di vista. Nel settore della carne, ci sono due aspetti particolarmente critici: l'efficienza della crescita muscolare e la qualità della carne risultante. Come componente principale del muscolo, le fibre muscolari sono direttamente legate alla performance di crescita e la qualità della carne fresca in animali 1. Ad esempio, il numero totale di fibre (TNF) e l'area trasversale di fibre (CSAF) in gran parte determinano la massa muscolare e la qualità della carne; Inoltre, Fibra Tipologia Composizione (FTC) influenza fortemente la qualità della carne fresca 2. Pertanto, la manipolazione delle caratteristiche della fibra muscolare negli animali è un metodo molto efficace per aumentare la redditività core e competitività delle aziende 1.
Fino ad oggi, diversi fattori intrinseci ed estrinseci sono stati identificati per manipolare fibra muscolare caratteristica atmosferaCI 1. Questa manipolazione può essere ottenuto attraverso la selezione mirata di animali con geni specifici, come il gene miostatina nei bovini 3, il gene Callipyge nelle pecore 4, e la RYR1 e geni IGF2 nei suini 5. Inoltre, controllo della dieta e trattamenti con ormoni specifici svolgono un ruolo importante nelle caratteristiche della fibra muscolare 6. Così, un approccio che combina i fattori genetici e nutrizionali potrebbe essere in grado di migliorare tenore di carne magra e la qualità della carne. Tuttavia, gli studi sulle fibre muscolari sono limitati nel settore della carne, perché la spiegazione della struttura delle fibre muscolari è ancora una sfida.
proprietà delle fibre muscolari vengono identificati mediante metodi istochimici, quali il test miosina adenosina trifosfatasi (ATPasi). Questo metodo si basa sul fatto che gli enzimi trova a sezioni sottili (6-8 micron) congelati difibre muscolari possono essere fatti reagire chimicamente con alcuni prodotti. Tuttavia, il contenuto di acqua dei muscoli è maggiore del 75% nei suini, conigli, topi, ed esseri umani, indipendentemente dalla posizione (cioè, schiena, addome, o degli arti posteriori) 7. Tale elevato contenuto di umidità nei muscoli causa un problema di frequente riscontro – artefatti congelamento – durante la preparazione di criosezioni, come precedentemente descritto 8, 9. Nella maggior parte dei casi, è quasi impossibile per congelare in modo appropriato tessuti muscolari in una linea di produzione di macellazione, secondo la nostra esperienza.
Il protocollo presentato qui descrive un metodo semplice ed efficace utilizzato nel nostro laboratorio di congelare i tessuti muscolari per criosezionamento in maniera high-throughput. Il culmine di questo metodo è un nuovo esageratamente che è progettato per i tessuti muscolari flash congelamento in azoto liquido. Il flusso di lavoro corrente può contemporaneamente facilitare tessutocongelamento e lavorazione per un'eccellente cryosection muscolare, con un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile e la stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante. Inoltre, questo protocollo può essere applicata a una vasta gamma di opzioni per l'analisi dei tessuti perché l'azoto liquido non si mescola con i tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un nuovo, multiforo esageratamente per il congelamento e la conservazione tessuti muscolari per effettuare valutazioni istologiche della funzione muscolare. La fase critica modificato in questo protocollo è che il campione nella esageratamente fori multipli è direttamente immersa in azoto liquido. A nostra conoscenza, questo è il modo più semplice e rapidest di ottenere campioni congelati eccellenti per criosezionamento muscolare tra i metodi di congelamento esistenti (vedere i risultati rappresenta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturali della Cina (NSFC): 31.301.950 e 31.671.288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing–relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
