Мульти-отверстие криопробирку Исключает Замораживание Артефакты при мышечной ткани непосредственно погружали в жидкий азот
Summary
Этот протокол описывает процедуру, чтобы заморозить мышечную ткань, погружая их непосредственно в жидкий азот. Этот протокол также подчеркивает новый криопробирку, которые могут избежать «эффекта» веерной газообразного азота, когда жидкость контактирует азота поверхность ткани образца.
Abstract
Исследования по физиологии скелетной мышцы сталкиваются с технической проблемой соответствующей обработки образцов, чтобы получить участки с четко видимыми цитоплазматическими отсеками. Другим препятствием является жесткой аппозиция миофибрилл в окружающие ткани. Поскольку процесс фиксации ткани и парафин приводит к усадке мышечных волокон, замораживание является оптимальным средством упрочнения мышечной ткани для секционирования. Тем не менее, обычно встречается проблема, образование кристаллов льда, происходит во время приготовления замороженных срезов из-за высокого содержания воды в мышцах. Протокол, представленные здесь в первую очередь описывает простой и эффективный метод замораживания должным мышечной ткани путем погружения их в жидком азоте. Проблема с использованием жидкого азота в одиночку является то, что он приводит к образованию газового барьера азота рядом с тканью, которая действует как изолятор и препятствует охлаждению тканей. Чтобы избежать этого эффекта «пара одеяла», а пж криопробирка была разработана, чтобы увеличить скорость потока жидкости вокруг поверхности ткани. Это было достигнуто путем штамповки в общей сложности 14 впускных отверстий в стенке флакона. В соответствии с динамикой пузыря, более высокая скорость потока жидкости приводит в небольших пузырьков и меньше шансов образовать газовый барьер. Когда жидкий азот поступает в криопробирку через впускные отверстия, скорость потока вокруг ткани достаточно быстро, чтобы устранить газовый барьер. По сравнению с методом замораживания мышечной ткани с использованием предварительно охлажденный изопентана, этот протокол является более простым и более эффективным и может быть использован, чтобы заморозить мышцы в пропускной способности образом. Кроме того, этот метод является оптимальным для учреждений, которые не имеют доступ к изопентану, что крайне воспламеняется при комнатной температуре.
Introduction
Скелетная мышца является наиболее ценным компонентом мяса по производству животного из пищевой и перерабатывающей точки зрения. В мясной промышленности, есть два особенно важный аспект: эффективность роста мышц и качество получаемого мяса. В качестве основного компонента мышцы, мышечные волокна имеют непосредственное отношение к динамике роста и свежему качеству мяса у животных 1. Например, общее количество волокон (TNF), и площадь поперечного сечения волокон (CSAF), в основном определяют мышечную массу и качество мяса; Кроме того , Тип волокна Состав (FTC) сильно влияет на качество свежего мяса 2. Таким образом, манипулирование характеристик мышечных волокон у животных является весьма эффективным методом для повышения рентабельности и основной конкурентоспособности ферм 1.
На сегодняшний день, несколько внутренних и внешних факторов, были идентифицированы, чтобы манипулировать мышечных волокон characteristектронные 1. Эта манипуляция может быть достигнуто за счет целенаправленного отбора животных с определенными генами, такими как миостатин гена у крупного рогатого скота, 3 гена Callipyge у овец, 4 и RYR1 и генов Igf2 у свиней 5. Кроме того , контроль диеты и лечение с определенными гормонами играют важную роль в мышечных волокнах характеристик 6. Таким образом, подход, который сочетает в себе генетические и пищевые факторы могут быть в состоянии улучшить постное содержание мяса и качество мяса. Однако исследования мышечных волокон ограничены в мясной промышленности, так как выяснение структуры мышечных волокон, по-прежнему является проблемой.
свойства мышечного волокна, идентифицируют с использованием гистохимических методов, таких как анализ миозина аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы). Этот метод основан на том факте, что ферменты, расположенной в тонких (6-8 мкм) замороженных секциймышечные волокна могут быть химически реагируют с определенными продуктами. Однако, содержание воды в мышцах у свиней, кроликов, мышей и человека больше , чем 75%, независимо от положения (то есть спины, живота или задних конечностей) 7. Такое высокое содержание влаги в мышцах вызывает часто встречается вопрос – замораживание – артефакты при подготовке криосрезов, как описано ранее , 8, 9. В большинстве случаев это практически невозможно правильно заморозить мышечные ткани в производственной линии скотобойни, согласно нашему опыту.
Протокол, представленные здесь описывает простой и эффективный метод, используемый в нашей лаборатории, чтобы заморозить мышечные ткани для cryosectioning в высокой пропускной образом. Момент этого метода является новой криопробиркой, который предназначен для флэша-замораживания мышечной ткани в жидком азоте. Тока рабочий процесс может одновременно облегчить тканизамораживания и обработки для отличной мышечной cryosection, с четко видимым цитоплазматическим отсеком и плотно аппозициями миофибрилл к окружающей ткани. Кроме того, этот протокол может быть применен к широкому спектру вариантов для анализа ткани, потому что жидкий азот не смешивается с тканями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем новую, с несколькими отверстиями для криопробирки замораживания и хранения мышечной ткани для выполнения гистологических оценок функции мышц. Критические модифицированы шагом в этом протоколе является то, что образец в многодырчатой криопробирке непосредстве?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC): 31301950 и 31671288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing–relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
