Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans l'azote liquide
Summary
Ce protocole décrit un procédé pour congeler les tissus musculaires en les plongeant directement dans l'azote liquide. Ce protocole met également en évidence une nouvelle cryovial qui permet d'éviter « l'effet de couverture » de l'azote gazeux lorsque les contacts de l'azote liquide de la surface tissulaire d'un échantillon.
Abstract
Les études sur la physiologie des muscles squelettiques doivent relever le défi technique du traitement de façon appropriée les échantillons pour obtenir des sections avec des compartiments cytoplasmiques clairement visibles. Un autre obstacle est serré de l'apposition myofibres aux tissus environnants. Du fait que le processus de fixation de tissu et inclusion dans la paraffine conduit à la contraction des fibres musculaires, la congélation est un moyen optimal de durcissement des tissus musculaires pour le sectionnement. Cependant, un problème fréquemment rencontré, la formation de cristaux de glace, se produit lors de la préparation des coupes congelées en raison de la forte teneur en eau du muscle. Le protocole présenté ici d'abord décrit une méthode simple et efficace pour la congélation correctement les tissus musculaires en les plongeant dans de l'azote liquide. Le problème avec l'utilisation de l'azote liquide seul est qu'il provoque la formation d'une barrière de gaz d'azote à côté du tissu, qui agit comme un isolant et empêche le refroidissement des tissus. Pour éviter cet effet « couverture vapeur », un new cryovial a été conçu pour augmenter la vitesse d'écoulement du liquide autour de la surface du tissu. Ceci a été réalisé en découpant un total de 14 trous d'entrée dans la paroi du flacon. Selon la dynamique des bulles, un taux plus élevé de résultats d'écoulement de liquide en bulles plus petites et moins de chances de former une barrière contre les gaz. Lorsque l'azote liquide circule dans le tube cryogénique à travers les trous d'entrée, la vitesse d'écoulement à travers le tissu est suffisamment rapide pour éliminer la barrière de gaz. Par rapport à la méthode de congélation des tissus musculaires en utilisant isopentane prérefroidi, ce protocole est plus simple et plus efficace et peut être utilisé pour geler les muscles de façon débit. De plus, cette méthode est optimale pour les institutions qui n'ont pas accès à isopentane, qui est extrêmement inflammable à la température ambiante.
Introduction
Le muscle squelettique est le composant le plus précieux d'un animal producteur de viande du point de vue nutritionnel et de traitement. Dans l'industrie de la viande, il y a deux aspects particulièrement critiques: l'efficacité de la croissance musculaire et la qualité de la viande résultant. En tant que composant principal du muscle, les fibres musculaires sont directement liées à la performance de la croissance et la qualité de la viande fraîche chez les animaux 1. Par exemple, le nombre total de fibres (TNF) et la zone transversale des fibres (CSAF) déterminent principalement la masse musculaire et la qualité de la viande; En outre, le type de fibre Composition (FTC) affecte fortement la qualité de la viande fraîche 2. Par conséquent, la manipulation des caractéristiques de la fibre musculaire chez les animaux est une méthode très efficace pour augmenter la rentabilité de base et de la compétitivité des exploitations 1.
À ce jour, plusieurs facteurs intrinsèques et extrinsèques ont été identifiés pour manipuler la fibre musculaire caractéristique etics 1. Cette manipulation peut être réalisé par la sélection ciblée des animaux avec des gènes spécifiques, tels que le gène de myostatine chez les bovins 3, le gène Callipyge chez le mouton 4, et les gènes RYR1 et IGF2 chez les porcs 5. En outre, le contrôle de l' alimentation et des traitements avec des hormones spécifiques jouent un rôle important dans les caractéristiques des fibres musculaires 6. Ainsi, une approche qui combine des facteurs génétiques et nutritionnels pourrait être en mesure d'améliorer la teneur en viande maigre et la qualité de la viande. Cependant, des études sur les fibres musculaires sont limitées dans l'industrie de la viande parce que l'élucidation de la structure des fibres musculaires est toujours un défi.
les propriétés des fibres musculaires sont identifiés en utilisant des procédés histochimiques, tels que le dosage de l'adénosine triphosphatase de myosine (ATPase). Cette méthode repose sur le fait que les enzymes situé dans des coupes congelées minces (6-8 pm) deles fibres musculaires peuvent être amenés à réagir chimiquement avec certains produits. Cependant, la teneur en eau des muscles est supérieure à 75% chez les porcs, les lapins, les souris et les humains, quelle que soit la position (c. -à- dos, l' abdomen, ou des membres postérieurs) 7. Un tel taux d'humidité élevé dans les muscles provoque un problème fréquemment rencontré – artefacts de congélation – lors de la préparation de coupes cryogéniques, comme décrit précédemment 8, 9. Dans la plupart des cas, il est presque impossible de geler de façon appropriée les tissus musculaires dans une ligne de production d'abattoir, selon notre expérience.
Le protocole présenté ici décrit une méthode simple et efficace utilisé dans notre laboratoire pour geler les tissus musculaires pour cryosectioning de manière à haut débit. Le point culminant de cette méthode est une nouvelle cryovial qui est conçu pour les tissus musculaires surgélation dans l'azote liquide. Le flux de travail peut faciliter en même temps que le tissucongélation et de traitement pour un excellent cryosection musculaire, avec un compartiment cytoplasmique clairement visible et l'apposition serré de fibres musculaires au tissu environnant. De plus, ce protocole peut être appliqué à un large éventail d'options pour l'analyse des tissus parce que l'azote liquide ne se mélange pas avec les tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une nouvelle cryovial plusieurs trous pour la congélation et le stockage de tissus musculaires pour effectuer des évaluations histologiques de la fonction musculaire. L'étape critique dans la modification de ce protocole est que l'échantillon dans le tube cryogénique à trous multiples est immergé directement dans de l'azote liquide. À notre connaissance, c'est la façon la plus simple et rapidest pour obtenir d'excellents échantillons congelés pour cryosectioning muscula…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC): 31301950 et 31671288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
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